牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要由A型、C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā),對畜牧業(yè)的危害極大,尚無有效的防控措施。本研究擬通過克隆及原核表達(dá)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素基因及D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因,為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。臨床分離鑒定牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌17株,經(jīng)單因子毒素ELISA檢測及多重PCR分型,最終鑒定出A型產(chǎn)氣莢膜梭菌10株、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌4株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌3株。通過小鼠半數(shù)致死量試驗(yàn)選擇毒力強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)�？寺ˇ�、β2及ε毒素基因片段,構(gòu)建克隆載體pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε。將鑒定正確的基因片段分別插入到原核表達(dá)載體pET-32a（+）中,構(gòu)建毒素基因原核表達(dá)載體pET-32a（+）-α、pET-32a（+）-β2和pET-32a（+）-ε,將構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）菌株中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Western blot檢測表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果表明,成功構(gòu)建克隆載體pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε,目的基因片段分別為 1092 bp、987 bp 和 798 b... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１病牛剖檢?

?內(nèi)蒙古民族大學(xué)碩士學(xué)位論文?１５??室溫孵育２?ｈ；??（７）二抗孵育結(jié)束后，ＴＢＳＴ洗滌條帶５次，８?ｍｉｎ／次；??（８）顯影：按照碧云天ＥＣＬ超敏顯影液試劑盒說明書將Ａ液和Ｂ液１：１混合，??避光保存，將條帶放入Ｔａｎｏｎ?２５００凝膠成像系統(tǒng)觀察。??３實(shí)驗(yàn)結(jié)果??３．１產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定??３．１．１臨床癥狀及剖檢結(jié)果??病牛臥地不起，飲食欲廢絕，逐漸死亡，剖檢可見腹部鼓氣，脾臟腫大，腎臟??腫大，肝臟有出血點(diǎn)，胸腔、腹腔和心包有積液，空腸和回腸嚴(yán)重出血，腸系膜有??出血點(diǎn)（圖１和圖２）。??圖１病牛剖檢?圖２牛腸道病變??Ｆｉｇ．ｌ?Ｎｅｃｒｏｐｓｙ?ｏｆ?ｄｉｅａｓｅｄ?ｃａｔｔｌｅ?Ｆｉｇ．２?Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ?ｌｅｓｉｏｎｓ?ｉｎ?ｃａｔｔｌｅ??３．１．２培養(yǎng)及染色特性??在血瓊脂平板上３７°Ｃ培養(yǎng)１８－２４?ｈ，形成圓形、光滑、邊緣整齊的菌落，多數(shù)菌??株有雙圈溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)完全溶血，外環(huán)不完全溶血。在牛奶培養(yǎng)基內(nèi)可見洶涌發(fā)酵（圖??３）。在顯微鏡下可觀察到革蘭氏陽性粗大桿菌，大小約為兩端頓圓，??單個或成雙排列，芽孢橢圓形，直徑小于菌體，位于菌體中央或次級端，有莢膜，無??鞭毛（圖４）。??

＿１６?牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與ｃｕ?ｐ２＞?ｓ毒素基因的原核表達(dá)???圖３分離菌牛奶培養(yǎng)基培養(yǎng)?圖４革蘭氏染色鏡檢（１０００倍）??Ｆｉｇ．３?Ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｗｅｒｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｍｉｌｋ?ｍｅｄｉｕｍ?Ｆｉｇ．４?Ｇｒａｍ?ｓｔａｉｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?（１０００ｘ）??３．１．３菌株的生化鑒定結(jié)果??分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇和水??楊苷，明膠、Ｈ２Ｓ和卵磷脂試驗(yàn)均為陽性，脂酶試驗(yàn)陰性。菌株的生化特性符合產(chǎn)氣??莢膜梭菌的生化特性，置信度為９９％，具體結(jié)果見表１１。??表１１菌株生化試驗(yàn)結(jié)果??Ｔａｂ．?１１?Ｓｔｒａｉｎ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔ?ｒｅｓｕｌｔｓ??生化試驗(yàn)?結(jié)果?生化試驗(yàn)?結(jié)果??Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔｓ?Ｒｅｓｕｌｔｓ?Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔｓ?Ｒｅｓｕｌｔｓ??卵黃瓊脂（ＬＥＣ）?＋?葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）?＋??卵黃瓊脂（ＬＩＰ）?－?麥芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）?＋??口弓陳（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）?－?甘露醇（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）?－??鹿糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）?＋?山梨醇（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）?－??鼠李糖（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）?－?硝酸鹽（Ｎｉｔｒａｔｅ）?－??靛基質(zhì)（Ｉｎｄｏｌｅ）?－?尿素（Ｕｒｅａ）?－??木糖（Ｘｙｌｏｓｅ）?－?阿拉伯糖（Ａｒａｂｉｎｏｓｅ）?－??七葉靈（Ｅｓｃｕｌｉｎｅ）?－?乳糖（Ｌａｃｔｏｓｅ）?＋??纖維二糖（Ｃｅｌｌｏｓｅ）?－?松三糖（Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）?－?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3013976