2013年H7N9新發(fā)突發(fā)流感疫情不僅給人類生活造成了嚴(yán)重的干擾和危害,也對我國養(yǎng)禽業(yè)造成了毀滅性的打擊,疫苗研制是防控H7N9流感的必要技術(shù)儲備。DNA疫苗能夠同時誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),具有良好的交叉免疫保護(hù)力,而且制備簡單,被認(rèn)為是應(yīng)對頻繁變異的禽流感病毒（AIV）感染的理想疫苗。為了研制能夠有效抵御H7N9流感的DNA疫苗,將H7N9流感病毒A/Anhui/1/2013（H7N9）[AH/1/2013（H7N9）]的HA基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化和全基因合成,分別插入到載體pVAXl和pCAGGS中,構(gòu)建了2種DNA質(zhì)粒：pVAH7和pCAH7。將構(gòu)建好的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行間接免疫熒光、激光共聚焦和Western blot驗(yàn)證,結(jié)果表明,兩種DNA質(zhì)粒均可以在293T細(xì)胞中表達(dá),表達(dá)的HA蛋白定位于細(xì)胞膜上。為評價(jià)質(zhì)粒pVAH7和pCAH7對SPF雞的免疫效力,將pVAH7以60μg劑量,pCAH7以15μg和60μg的劑量單次或加強(qiáng)免疫3周齡SPF雞,分別在首次免疫后7周和加強(qiáng)免疫后4周在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室以106EIDs。的流感病毒A/Chicken/Sha... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒pVAH7的酶切分析鑒定

經(jīng)雙酶切之后獲得了一條大小約為1707bp的HA片段和一條大約為SOOObp的pVAXl片段，結(jié)果與預(yù)期相符（圖2-2)；；測序結(jié)果也表明目的基因HA正確插入到pVAXl載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。1 M 2?"?3000b{K'1707bjK'1: pVAR-^ digested by EcoR lafi'd Xho I; 2: pVAXl;M: DNAm^ker(W(X>Obp)^圖2-2 m P耀7的滅切分祈驗(yàn)Ftg-2-2 Identification ofpVAH7 by restrtction snzyme double digestwrn^*"'2.2.2間接免疫焚光(I FA)檢測結(jié)果pVAH7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可表達(dá)特異的H7N9流感病毒HA蛋白，只轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞陰性對照及陰性血清對照均未見有焚光表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明PVAH7重組質(zhì)�？梢栽�293T細(xì)胞中高效表達(dá)且只與陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2-3)。INIRm!A. 293T cells transfected with p VAH7 at 48h： B. Transfected cells with Negative serum control； C. empty vectorcontrolA.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGoAHHA48小時后的293T細(xì)胞；B.—抗是陰性血清的對照；C.空載體轉(zhuǎn)染對照圖2_3 PVAH7轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的間接免疫焚光Fig. 2-3 Identification of HA protein oq^ression from pVAH7 in transfected 293T cells by IF A14

圖2-4 optiAH7蛋白在293T細(xì)包中的定■(立Fig .Localization of protein ofoptiAH? in 293Tcelis2. 4 pVAH7 重組蛋白的 Western-bo It 鑒定按照2. 1.9中的方法，用pVAH7轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h之后進(jìn)行Western blot鑒定，掃膜后可

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本文編號：3013388