本文關(guān)鍵詞：紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯與凋亡及凋亡通路研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum)作為一種世界性入侵有毒有害雜草,可致家畜一系列中毒表現(xiàn)及病理變化。本試驗(yàn)旨在探索紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯及肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。本試驗(yàn)以16只5-6月齡健康薩能奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物,隨機(jī)均分成對(duì)照組及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,分別飼喂含0%、40%、60%和80%紫莖澤蘭混合日糧3個(gè)月,運(yùn)用透射電鏡(TEM)、DNA梯度法(DNA Ladder)、DNA原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)、蛋白印跡法(Western Blot)、熒光定量PCR (qRT-PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等實(shí)驗(yàn)手段,研究薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯時(shí)期與肝細(xì)胞凋亡及凋亡通路分子機(jī)理,為紫莖澤蘭毒理學(xué)研究與毒草毒性作用機(jī)制提供理論依據(jù)。其研究?jī)?nèi)容如下：1.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯。FCM結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各試驗(yàn)組肝細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)極顯著降低(P0.01),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組G0/Gj期肝細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高(P0.05,P0.01),試驗(yàn)Ⅰ組變化不顯著(P0.05)。各試驗(yàn)組PI值隨紫莖澤蘭添加劑量增加而下降,且試驗(yàn)Ⅱ組顯著降低(P0.05)、Ⅲ組極顯著降低(P0.01),但試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明,紫莖澤蘭能致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯于Go/G1期。2.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞凋亡。FCM結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)Ⅰ組正常細(xì)胞百分比顯著降低(P0.05),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著降低(P0.01)。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組Ⅰ組肝細(xì)胞早、晚期凋亡率顯著升高(P0.05),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組均極顯著升高(P0.01)。TUNEL結(jié)果顯示,對(duì)照組偶見(jiàn)凋亡肝細(xì)胞,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組發(fā)現(xiàn)大量被FITC標(biāo)記的凋亡肝細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野凋亡肝細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,試驗(yàn)Ⅰ組凋亡肝細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高(P0.05),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著升高(P0.01)。AO/EB雙染顯示：對(duì)照組肝細(xì)胞胞核呈均勻綠色,細(xì)胞形態(tài)完整。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組肝細(xì)胞胞核呈亮綠色致密板塊,部分呈橘紅色固縮狀,部分胞核胞膜破損且呈均勻紅色。DAPI染色顯示：對(duì)照組肝細(xì)胞胞核體積較大,呈均勻、微弱淡熒光,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組部分肝細(xì)胞染色呈高亮的熒光。DNA ladder結(jié)果顯示：對(duì)照組總DNA為一整條完整條帶,未出現(xiàn)明顯DNA ladder,各試驗(yàn)組均檢出DNA ladder條帶且表現(xiàn)出明顯劑量效應(yīng)。TEM結(jié)果顯示,對(duì)照組肝細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)完整,染色質(zhì)分布均勻,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組肝細(xì)胞胞核出現(xiàn)以染色質(zhì)濃縮、聚集并且邊緣化的凋亡特征。3.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡。本試驗(yàn)利用ELISA、Western blot(?)qRT-PCR方法,對(duì)凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Bid、 Cyt c、APAF-1、PARP、Fas、FasL和Caspase-3,-8,-9在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),Caspase活性法檢測(cè)Caspase-3,-8,-9活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),紫莖澤蘭致薩能奶山羊慢性中毒后,引起肝細(xì)胞Bax與Bcl-2在mRNA及蛋白水平上分別出現(xiàn)升高與下降,致Bax/Bcl-2比值下降、線粒體Cyt c釋放到胞漿、激活A(yù)PAF-1/Caspase-9凋亡小體形成、Caspase-3與PARP活化而造成線粒體功能紊亂。而Fas、FasL、Caspase-8、Bid未能顯著激活。上述結(jié)果表明,紫莖澤蘭可致肝細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,而外源性凋亡途徑未被激活。通過(guò)給飼薩能奶山羊40%、60%和80%三個(gè)劑量紫莖澤蘭發(fā)現(xiàn),紫莖澤蘭可致其肝細(xì)胞周期阻滯于Go/G1期,同時(shí)肝細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)提示紫莖澤蘭致肝細(xì)胞凋亡,最后通過(guò)對(duì)凋亡通路相關(guān)因子的激活表明線粒體凋亡通路的激活,而外源性凋亡途徑未被激活。
【關(guān)鍵詞】：紫莖澤蘭 細(xì)胞凋亡 周期阻滯 線粒體途徑 肝細(xì)胞 薩能奶山羊
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.87
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1 紫莖澤蘭簡(jiǎn)介13
• 2 紫莖澤蘭危害及開(kāi)發(fā)利用13-15
• 2.1 對(duì)畜牧業(yè)的危害13-14
• 2.2 對(duì)生態(tài)的危害14
• 2.3 紫莖澤蘭的開(kāi)發(fā)利用14-15
• 3 紫莖澤蘭有毒成分生物活性及中毒研究15-17
• 3.1 紫莖澤蘭主要有毒成分及其生物活性15
• 3.2 動(dòng)物紫莖澤蘭中毒15-17
• 4 細(xì)胞周期的研究進(jìn)展17
• 5 細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展17-20
• 5.1 細(xì)胞凋亡與壞死18-19
• 5.2 細(xì)胞凋亡途徑19-20
• 6 本試驗(yàn)研究目的和意義20-22
• 第二章 紫莖澤蘭對(duì)薩能奶山羊肝細(xì)胞周期的影響22-29
• 1 試驗(yàn)材料22-24
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組22
• 1.2 試驗(yàn)飼料配比及制備22-23
• 1.3 飼養(yǎng)管理23-24
• 1.4 主要試驗(yàn)材料24
• 2 試驗(yàn)方法24-25
• 2.1 試驗(yàn)方法24-25
• 2.2 數(shù)據(jù)處理25
• 3 試驗(yàn)結(jié)果25-27
• 3.1 肝細(xì)胞周期的變化25-27
• 4 分析與討論27-28
• 5 小結(jié)28-29
• 第三章 紫莖澤蘭對(duì)薩能奶山羊肝細(xì)胞凋亡的影響29-41
• 1 試驗(yàn)材料29-30
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組29
• 1.2 試驗(yàn)主要儀器與試劑29-30
• 2 試驗(yàn)方法30-32
• 2.1 肝細(xì)胞凋亡DNA ladder檢測(cè)30
• 2.2 TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡30-31
• 2.3 肝細(xì)胞AO/EB及DAPI染色31
• 2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡31-32
• 2.5 肝組織TEM觀察32
• 2.6 數(shù)據(jù)處理32
• 3 試驗(yàn)結(jié)果32-39
• 3.1 DNA ladder檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡32-33
• 3.2 TUNEL檢測(cè)結(jié)果33-35
• 3.3 AO/EB與DAPI染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡變化35-36
• 3.4 FCM檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡36-38
• 3.5 TEM結(jié)果38-39
• 4 分析與討論39-40
• 5 小結(jié)40-41
• 第四章 紫莖澤蘭對(duì)薩能奶山羊肝細(xì)胞凋亡通路影響41-65
• 1 試驗(yàn)材料41-44
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組41
• 1.2 試驗(yàn)儀器與試劑41-44
• 2 試驗(yàn)方法44-47
• 2.1 肝細(xì)胞Caspases活性檢測(cè)44
• 2.2 qRT-PCR檢測(cè)凋亡基因表達(dá)44-45
• 2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)凋亡蛋白45
• 2.4 Western-blot檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)45-47
• 2.5 數(shù)據(jù)處理47
• 3 試驗(yàn)結(jié)果47-62
• 3.1 肝細(xì)胞Caspase-3,-8,-9活力檢測(cè)結(jié)果47-48
• 3.2 肝細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3,-8,-9 mRNA表達(dá)水平48-50
• 3.3 ELISA檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3,-8,-9蛋白表達(dá)水平50-51
• 3.4 Western blot檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)51-62
• 4 分析與討論62-64
• 4.1 線粒體凋亡途徑的影響62-63
• 4.2 外源性凋亡途徑的影響63-64
• 5 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 致謝72-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73

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