由于誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的潛在應(yīng)用價值,其進(jìn)而成為近年的科研熱點(diǎn)。隨著研究的深入,誘導(dǎo)機(jī)制、誘導(dǎo)方法、誘導(dǎo)效率、臨床應(yīng)用以及建立不同物種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系等方面都得到顯著的進(jìn)展。目前,小鼠,大鼠,人類,恒河猴以及豬等物種的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系均已經(jīng)成功建立。然而,成功建立綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的報道相對較少,并且效率低下。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒傳遞系統(tǒng),以小鼠來源的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4個多能性基因以及miR-200c和miR-302 2個microRNA作為誘導(dǎo)因子,導(dǎo)入綿羊胚胎耳尖成纖維細(xì)胞,獲得綿羊誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞,并且進(jìn)行多能性檢測。為建立綿羊iPS細(xì)胞系方法的完善及探明綿羊iPSCs誘導(dǎo)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.誘導(dǎo)因子和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的準(zhǔn)備:無內(nèi)毒素提取攜帶Oct4、Sox2、klf4、c-Myc、miR-200c和miR-302的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,經(jīng)過純化進(jìn)一步提高質(zhì)粒濃度和純度。雙酶切鑒定后均出現(xiàn)理論長度的片段。應(yīng)用胰酶消化法制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和綿羊胚胎耳尖成纖維細(xì)胞。絲裂霉素C處理兩種細(xì)胞制備飼養(yǎng)層。復(fù)蘇包裝病毒的Plat-E細(xì)胞。... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 iPSCs的細(xì)胞特性
    1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)
    1.3 iPS細(xì)胞系的建立
        1.3.1 傳統(tǒng)建立iPS細(xì)胞系的方法
        1.3.2 優(yōu)化建立iPS細(xì)胞系的方法
        1.3.3 多物種的iPS細(xì)胞系建立
    1.4 iPSCs形成的分子機(jī)制
        1.4.1 多能性基因的激活
        1.4.2 多能性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.4.3 表觀遺傳修飾的重編程
        1.4.4 重編程中的細(xì)胞信號通路
    1.5 iPSCs的鑒定
        1.5.1 形態(tài)學(xué)檢測
        1.5.2 細(xì)胞生長特性檢測
        1.5.3 堿性磷酸酶活性檢測
        1.5.4 細(xì)胞特異性標(biāo)記基因表達(dá)檢測
        1.5.5 全基因組基因表達(dá)水平檢測
        1.5.6 表觀遺傳學(xué)重編程的檢測
        1.5.7 細(xì)胞分化潛能的檢測
    1.6 iPSCs的應(yīng)用
        1.6.1 疾病模型和藥物開發(fā)中的應(yīng)用
        1.6.2 組織器官工程中的應(yīng)用
        1.6.3 受損組織修復(fù)中的應(yīng)用
    1.7 研究意義
2 綿羊iPS細(xì)胞系的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒以及實(shí)驗(yàn)菌株
        2.1.2 主要試劑以及藥品
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液的配制
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 多能性誘導(dǎo)因子的準(zhǔn)備
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的準(zhǔn)備及培養(yǎng)
        2.2.3 誘導(dǎo)重編程因子的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵染
        2.2.5 iPSCs克隆的挑取
        2.2.6 iPSCs的擴(kuò)增與培養(yǎng)
        2.2.7 iPSCs的鑒定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 誘導(dǎo)因子的準(zhǔn)備及鑒定
        2.3.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的狀態(tài)
        2.3.3 不同飼養(yǎng)層培養(yǎng)iPSCs的比較
        2.3.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率
        2.3.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵染效率
        2.3.6 iPSCs克隆的獲取時間
        2.3.7 iPSCs的擴(kuò)增與培養(yǎng)
        2.3.8 堿性磷酸酶染色
        2.3.9 免疫熒光染色
        2.3.10 甲基化檢測
        2.3.11 甲基化水平差異
    2.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：2978113