20世紀(jì)80年代基因打靶技術(shù)的興起極大地推動了發(fā)育生物學(xué)的研究和生物醫(yī)藥的開發(fā)，基因研究從最初的測序和圖譜繪制逐漸發(fā)展為基因功能研究與基因致病機制解析，使現(xiàn)代生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究取得了突破性進(jìn)展。長期以來基因打靶技術(shù)主要在小鼠上完成，這是因為小鼠的胚胎干細(xì)胞能在體外培養(yǎng)并無限增殖，同時保持生殖系嵌合能力。但是利用小鼠制備的人類疾病模型往往不能真實反映人類疾病的發(fā)生和發(fā)展，甚至在諸多疾病中其癥狀與人類截然不同，人們一直在尋找與人的解剖和生理更為接近的大動物作為人類疾病的動物模型。在大動物中,豬在生理結(jié)構(gòu)、生化特征以及營養(yǎng)代謝等方面與人更為接近，被認(rèn)為是目前比較理想的大動物基因修飾模型。自2000年P(guān)PL公司成功利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備克隆豬以來，基因修飾豬在異種器官移植研究、人類疾病模型以及農(nóng)業(yè)品種改良中取得了一系列突破性成果。但是由于豬胚胎干細(xì)胞的缺乏，目前只能對體細(xì)胞進(jìn)行基因打靶修飾結(jié)合核移植技術(shù)來制備基因修飾豬。而體細(xì)胞在體外培養(yǎng)增殖速度慢而且增殖能力有限，常規(guī)同源重組進(jìn)行基因打靶的效率極低。目前，只有少量文章報道了基因修飾豬的研究。因此，基因打靶技術(shù)的研發(fā)和改進(jìn)是加快基因修飾豬研究發(fā)... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

載體構(gòu)建流程圖

圖 1.2 位點特異性 TALEN 構(gòu)建流程圖Fig1.2 Construction of the TALEN vector1）根據(jù)設(shè)計的 TALEN 靶位點序列，將第 1-10 堿基對應(yīng)的 RVD 模塊和pFUS-A 依次加入 A 管中，第 11-（N-1）堿基個 RVD 模塊和 pFUS-B（N-1）依次加入 B 管中，連接反應(yīng)體系見表 1.5。表 1.5 連接反應(yīng)體系Tab1.5 Ligation systemComponent AmountEach RVD module vector 1μL(150ng)pFUS-A/pFUS-B 1μL(150ng)10×T4 DNA ligase buffer 2μL

引物序列（5’- 3’）TTGGCGTCGGCAAACAGTGGGGCGACGAGGTGGTCGTTGG測 TALEN 活性體系構(gòu)建le-strand annealing, SSA)是一種常用的色熒光蛋白 EGFP 作為報告基因。檢測整的同源 EGFP 片段,2 個片段之間被終 TALEN 將靶位點雙鏈 DNA 切割后，性獲得完整的 EGFP 序列，使綠色熒此，通過比較使用 TALEN 前后綠色熒外活性進(jìn)行檢測。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Rapid and Cost-Effective Gene Targeting in Rat Embryonic Stem Cells by TALENs[J]. Charles Ashton.  遺傳學(xué)報. 2012(06)
[2]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遺傳學(xué)報. 2012(05)



本文編號：2968687