為分離獲得豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）,對疑似PCV感染死亡的仔豬病料進(jìn)行PCR檢測,將檢測呈PCV3陽性的樣品利用PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,同時利用原核表達(dá)的Cap蛋白制備多克隆抗體,通過IFA、免疫電鏡和序列測定分析對分離株進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,分離獲得1株P(guān)CV3流行毒株,IFA檢測有特異性熒光;電鏡下可見圓形、直徑約為20 nm的病毒粒子;與PCV1、PCV2的同源性分別為22.2%、22.1%,屬于3a亞型,將其命名為LJ0603株。LJ0603株繁殖至第72小時病毒含量最高,且能穩(wěn)定傳代至第13代。PCV3 LJ0603株的獲得為其結(jié)構(gòu)功能和致病機(jī)制及免疫預(yù)防等研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(10)北大核心

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【部分圖文】：

PCV3Cap基因的擴(kuò)增Figure1AmplificationofPCV3CapgenebyPCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：心；2：肝；3：脾；4：腎；5：陰性對照

中國獸醫(yī)科學(xué)第50卷圖5PCV3LJ0603毒株的免疫電鏡觀察30000×Figure5ObservationofPCV3LJ0603byimmunoelectronmicroscopya：與病毒液作用后；b：與細(xì)胞液作用后。a：Afterinteractionwithvirussolution；b：Afterinteractionwithcellso-lution.ab圖4免疫熒光檢測結(jié)果Figure4Immunofluorescencetestresultsa：PCV3LJ0603感染的PK-15細(xì)胞（PCV3Cap蛋白多克隆抗體）；b：PK-15細(xì)胞對照（PCV3Cap蛋白多克隆抗體）；c：PCV3LJ0603感染的PK-15細(xì)胞（豬陽性血清）；d：PK-15細(xì)胞對照（豬陽性血清）。a：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；b：Negativecontrol（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；c：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.圖3重組Cap蛋白表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western-blot鑒定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)后菌體；2：誘導(dǎo)前菌體；3：誘導(dǎo)后空載體對照；4：純化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.圖2重組質(zhì)粒pET-32a-Cap的酶切鑒定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-32a-Cap的雙酶切產(chǎn)物；2：pET-32a-Cap的單酶切產(chǎn)物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.

dwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.圖3重組Cap蛋白表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western-blot鑒定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)后菌體；2：誘導(dǎo)前菌體；3：誘導(dǎo)后空載體對照；4：純化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.圖2重組質(zhì)粒pET-32a-Cap的酶切鑒定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-32a-Cap的雙酶切產(chǎn)物；2：pET-32a-Cap的單酶切產(chǎn)物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.對純化蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果顯示純化的Cap蛋白可以與His標(biāo)簽抗體（見圖3c）和PCV3豬陽性血清（見圖3d）反應(yīng)，表明目的條帶大小正確，具有較好的特異性。2.4PCV3的分離鑒定處理陽性樣品并接種于PK-15細(xì)胞傳代，對第8代接毒細(xì)胞使用IFA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，小鼠抗Cap多克隆抗體與PCV3豬陽性血清均可以與接毒細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光，PK-15細(xì)胞對照組無熒光（見圖4）。細(xì)胞病毒液與小鼠抗Cap多克隆抗體作用后，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有形態(tài)均一的病毒顆粒（見圖5），單個病毒粒子直徑約為20nm，與PCV3大小一致［10］，陰性對照未觀察到病毒粒子。將該毒株命名

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2011—2017年華東地區(qū)豬圓環(huán)病毒3型分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 李勇,姜辰龍,劉剛,姜平,白娟.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2018(08)
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碩士論文
[1]7種豬病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex檢測方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 肖璐.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]豬流行性腹瀉病毒NJ株的分離與鑒定[D]. 施雯.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：2963057