豬偽狂犬�。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的多種家畜及野生動(dòng)物共患的一種廣泛流行的急性傳染病,以發(fā)熱、奇癢（除豬外）、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征,妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)或死胎。該病在豬場(chǎng)多呈暴發(fā)流行,目前尚無(wú)治療PR的有效藥物,因此疫苗接種是控制該病發(fā)生和流行的主要措施。自2011年以來(lái),我國(guó)多個(gè)省份接種疫苗的豬群中發(fā)生嚴(yán)重的豬偽狂犬病,新出現(xiàn)的偽狂犬病病毒變異株對(duì)各個(gè)年齡的豬均具有致病性,意味著現(xiàn)有疫苗可能不能對(duì)當(dāng)前流行株提供完全的保護(hù),使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大風(fēng)險(xiǎn)。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的豬偽狂犬病變異株P(guān)RV-XJ株為材料,通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了不帶標(biāo)記基因的gE/gI雙缺失株及gE/gI/TK三缺失株,對(duì)重組病毒的生長(zhǎng)特性及免疫保護(hù)力進(jìn)行了初步探究,為研制偽狂犬病變異株重組疫苗及病毒載體疫苗奠定基礎(chǔ)。1、偽狂犬病毒gE/gI雙缺失株及gE/gI/TK三基因缺失株的構(gòu)建以vPRV-XJ株基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增gE/gI基因、TK基因兩側(cè)序列作為同源臂,以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP為篩選標(biāo)記,構(gòu)建帶有l(wèi)oxp位點(diǎn)的... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＰＲＶ病毒粒子結(jié)構(gòu)模式圖??Ｆｉｇ．?１－１．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＲＶ?ｖｉｒｉｏｎ?ｓｔｍｃｌｕｒｅ［１６］??

?李爽：豬偽狂犬病病毒變異株ｇＥ／ｇｌ／ＴＫ三基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力初步研究?３＿??１．３病毒分子生物學(xué)特征??１．３．１?ＰＲＶ基因組??ＰＲＶ的基因組為線性雙股ＤＮＡ?（圖卜２）?［１８］，基因組龐大約為１４５?ｋｂ，與ＥＨＶ－１，??ＢＨＶ－１和ＶＺＶ相似，其基因組在結(jié)構(gòu)上分為４部分：包括大小為９５?ｋｂ的長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（Ｕｎｉｑｕｅ??ｌｏｎｇ；ＵＬ）和９ｋｂ的短獨(dú)特區(qū)（Ｕｎｉｑｕｅｓｈｏｒｔ；ＵＳ）、ＵＳ區(qū)兩側(cè)的末端重復(fù)序歹ｉｊ?（ＴＲ）和內(nèi)??部重復(fù)序列（ｍｙ１６１。因?yàn)椋校遥值幕蚪MＵＳ區(qū)兩側(cè)存在重復(fù)序列，所以病毒在復(fù)制過(guò)程??中能產(chǎn)生兩種同分異構(gòu)體，這兩種同分異構(gòu)體均具有感染性，具有相同的生物活性，且在??感染機(jī)體內(nèi)等量存在［１６，｜７］�；蚪MＧ＋Ｃ含量高達(dá)７４．５％，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是皰疹病毒中Ｇ＋Ｃ??含量最高的［６，１７１。目前，ＰＲＶ整個(gè)基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成，通過(guò)多項(xiàng)研究和試驗(yàn)數(shù)據(jù)??分析結(jié)果證明，ＰＲＶ基因組含有７０個(gè)以上基因，６７個(gè)開(kāi)放閱讀框，可以編碼７０到１００個(gè)??蛋白質(zhì)，但其中有大約一半基因是病毒復(fù)制非必需的，可以在這些基因之間作為載體加入外??源基因序列。??

對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒Ｔ－ＧＦＰ用及ｍ雙酶切，將ＧＦＰ基因片段連接到相同酶處??理的ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化后搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為??ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ?（圖１－１）。鑒定正確的菌液使用甘油凍存，－７０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??２．６?ｇＥ／ｇｌ雙基因缺失株的構(gòu)建及純化??２．６．１重組質(zhì)粒ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ的提取??按照Ｏｍｅｇａ公司去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒Ｐｌａｓｍｉｄ?Ｍｉｎｉ?Ｋｉｔｎ，Ｖ（ｃａｐｐｅｄ）?Ｓｐｉｎ說(shuō)明書??操作。??２．６．２轉(zhuǎn)移載體ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ與ＰＲＶ基因組的共轉(zhuǎn)染??采用磷酸鈣方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參考Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作，具體??步驟如下：??（１）

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬偽狂犬病毒浙江株感染性細(xì)菌人工染色體克隆的構(gòu)建[J]. 尹文玲,尹龍勃,葉偉成,孫學(xué)強(qiáng),姚火春,張淼濤,王一成,張存.  病毒學(xué)報(bào). 2010(04)
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[8]從偽狂犬病病毒中刪除Cre/LoxP介導(dǎo)的報(bào)告基因[J]. 蘇鑫銘,于春梅,王敏秀,陳勇軍,曹瑞兵,周斌,陳溥言.  病毒學(xué)報(bào). 2006(06)
[9]豬偽狂犬基因工程疫苗研究進(jìn)展[J]. 樊淑華,李文剛,吳鳳筍,盧中華.  鄭州牧業(yè)工程高等�？茖W(xué)校學(xué)報(bào). 2005(02)
[10]偽狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒種特性研究[J]. 陳陸,郭萬(wàn)柱,殷華平,查光明.  中國(guó)病毒學(xué). 2005(02)

碩士論文
[1]表達(dá)綠色熒光蛋白的豬偽狂犬病病毒與豬細(xì)小病毒VP2基因的重組病毒的構(gòu)建[D]. 楊慧敏.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：2943730