發(fā)布時間：2017-04-08 06:06

  本文關鍵詞：同時識別1和3型鴨甲肝病毒的單抗及膠體金試紙條研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鴨甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雛鴨發(fā)生急性、高度致死性傳染病。主要感染3周齡以下的雛鴨,其中1周齡以內的雛鴨死亡率高達95%,主要特征病變?yōu)榛疾▲喌母闻K腫大和出血。本試驗開展了DHAV病毒單克隆抗體及膠體金試紙條制備和快速診斷等研究,結果如下：1.DHAV單克隆抗體的制備及初步鑒定用血清1型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-1) X株病毒尿囊液接種鴨胚,收集24-72h死亡的鴨胚尿囊液,將含DHAV-1病毒的尿囊液與等量的氯仿混合,抽提3次,除去脂類以及一些雜蛋白,然后在40000 r/min離心2 h,用PBS重懸病毒并使病毒蛋白含量為0.5 mg/mL,作為制備單克隆抗體的抗原免疫6周齡的BALB/c雌性小鼠。取免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤進行了細胞融合、篩選,再用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行3次亞克隆,最終得到5株可以穩(wěn)定分泌特異性抗體的陽性雜交瘤細胞,分別命名為1#、2#、3#、4#}和5#雜交瘤細胞株。經(jīng)鑒定,1#單克隆抗體類型屬于IgM,2#單克隆抗體類型屬于IgG1,3#單克隆抗體類型屬于IgG2b,4#和5#單克隆抗體類型屬于IgG2a。純化后單抗腹水的效價均在2×105以上;5株雜交瘤細胞株穩(wěn)定性均較好,經(jīng)過體外傳代以及細胞凍存復蘇仍能穩(wěn)定分泌抗體。5株單克隆抗體的相對親和常數(shù)都在109數(shù)量級以上,具有較好的抗原結合能力,其中3#單克隆抗體的親和力更高。2.膠體金試紙條的研制及應用用純化的2#單克隆抗體進行膠體金標記制備成金標抗體,經(jīng)過試驗條件的優(yōu)化,確定了膠體金與抗原的最佳標記量為34μg/mL,最佳標記的pH值確定0.1mol/L K2CO3加入量為12μL/mL;將純化的兔抗DHAV-1多抗包被于NC膜的T線上作為檢測線,羊抗鼠IgG包被于NC膜的C線上作為對照線,制成雙抗體夾心法檢測DHAV的膠體金免疫層析試紙條。對膠體金試紙條T線和C線濃度的優(yōu)化,確定檢測線上的兔抗DHAV-1多抗的最佳標記量為1 mg/mL,對照線上羊抗鼠IgG最佳標記量為1 mg/mL。在特異性試驗中,檢測4株DHAV-1和6株DHAV-3呈陽性反應,對鴨常見的其它致病病原(鴨瘟病毒、鴨大腸桿菌、鴨坦布蘇病毒、鴨沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌等)檢測均為陰性；對DHAV-1最低檢出量為0.9μg, DHAV-3最低檢出量為1.8 μg。試紙條在4℃、室溫和37℃至少可以保存3個月；批間和批內試紙條對樣品檢測的重復性較好。本試驗制備的試紙條與RT-PCR同時檢測臨床樣本的陽性符合率為96.5%(111/115),陰性符合率為97.9%(46/47)。該膠體金試紙條具有較好靈敏度、特異性、重復性和穩(wěn)定性。
【關鍵詞】：鴨甲型肝炎病毒 單克隆抗體 膠體金 抗原檢測
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.32
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 常用英文縮寫詞匯6-13
• 文獻綜述13-21
• 1. 鴨病毒性肝炎研究進展概況13-18
• 1.1 引言13
• 1.2 鴨病毒性肝炎的歷史與分布13-14
• 1.3 鴨肝炎病毒的病原學14
• 1.4 流行病學14
• 1.5 臨床癥狀和病理變化14-15
• 1.6 DHAV分子生物學15
• 1.7 鴨肝炎病毒的診斷15-18
• 1.7.1 根據(jù)臨床癥狀進行初步診斷15-16
• 1.7.2 分子生物學診斷16
• 1.7.3 血清學診斷16-18
• 2. 單克隆抗體技術18-19
• 3. 膠體金的研究概況及應用19-20
• 4. 選題目的和意義20-21
• 第一章 鴨甲型肝炎病毒單克隆抗體的制備及鑒定21-41
• 1. 材料21-23
• 1.1 細胞、菌株與毒株21
• 1.2 試驗動物21
• 1.3 試劑、材料21
• 1.4 主要試劑的配制21-22
• 1.4.1 細胞培養(yǎng)試劑21-22
• 1.4.2 ELISA相關試劑的配制22
• 1.4.3 SDS-PAGE電泳相關溶液22
• 1.5 儀器設備22-23
• 2. 試驗方法23-31
• 2.1 DHAV-1單克隆抗體的制備23-29
• 2.1.1 DHAV-1抗原的制備及純化23-24
• 2.1.2 免疫方法24
• 2.1.3 檢測DHAV-1抗體間接ELISA方法的建立24-25
• 2.1.4 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞的培養(yǎng)25-26
• 2.1.5 飼養(yǎng)層細胞、免疫小鼠脾細胞的制備26-27
• 2.1.6 細胞融合27
• 2.1.7 雜交瘤細胞的篩選及亞克隆27-28
• 2.1.8 雜交瘤細胞的傳代、凍存及復蘇28
• 2.1.9 單克隆抗體的大量制備28
• 2.1.10 單克隆抗體的純化28-29
• 2.2 單克隆抗體特性鑒定29-31
• 2.2.1 單克隆抗體亞型的鑒定29
• 2.2.2 單克隆抗體特異性鑒定29-30
• 2.2.3 雜交瘤細胞穩(wěn)定性測定30
• 2.2.4 各株單抗ELISA效價測定30
• 2.2.5 單抗識別抗原位點的相加試驗分析30-31
• 2.2.6 單抗親和常數(shù)的測定31
• 3. 結果31-39
• 3.1 基于DHAV-1全病毒的間接ELISA方法的構建31-34
• 3.1.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的條件優(yōu)化31-32
• 3.1.2 最佳酶標抗體濃度32
• 3.1.3 最佳封閉液、封閉時間的優(yōu)化32
• 3.1.4 包被條件的確定32-33
• 3.1.5 顯色時間的確定33
• 3.1.6 血清孵育時間的確定33
• 3.1.7 二抗孵育時間的確定33-34
• 3.1.8 臨界值的確定34
• 3.2 脾細胞、飼養(yǎng)細胞及SP2/0細胞34-35
• 3.3 細胞融合35
• 3.4 腹水單抗的制備和純化35-36
• 3.5 抗體亞類鑒定36
• 3.6 細胞培養(yǎng)上清及腹水效價的測定36
• 3.7 雜交瘤細胞株的穩(wěn)定性36-37
• 3.8 特異性37-38
• 3.9 單抗親和常數(shù)的測定38
• 3.10 單抗抗原表位的初步鑒定38-39
• 4. 討論39-41
• 4.1 病毒純化39
• 4.2 細胞融合及篩選39-40
• 4.3 單抗特性40-41
• 第二章 檢測1和3型鴨甲肝病毒膠體金試紙條的研制41-61
• 1. 材料41-42
• 1.1 毒株與菌株41
• 1.2 試劑、材料41
• 1.3 主要試劑的配置41
• 1.4 儀器設備41-42
• 2. 試驗方法42-48
• 2.1 玻璃器皿的清潔42
• 2.2 膠體金顆粒質量鑒定42
• 2.2.1 肉眼觀測42
• 2.2.2 紫外掃描鑒定42
• 2.3 待標記抗體的處理42
• 2.4 金標單克隆抗體的制備和純化42-44
• 2.4.1 最適標記K_2CO_3的量42-43
• 2.4.2 單克隆抗體最適穩(wěn)定量43-44
• 2.4.3 單克隆抗體的膠體金標記44
• 2.4.4 金標單克隆抗體的純化44
• 2.5 試紙條最佳試驗條件的優(yōu)化44-45
• 2.5.1 純化的兔抗DHAV-1 IgG的包被濃度的確定44
• 2.5.2 羊抗鼠IgG的包被濃度的確定44-45
• 2.5.3 膠體金標記的單克隆抗體的稀釋度的確定45
• 2.5.4 試紙條組成材料的選擇45
• 2.6 膠體金試紙的組裝45-46
• 2.7 檢測程序與結果判定46-47
• 2.7.1 鴨胚尿囊液或者菌體培養(yǎng)液的處理46
• 2.7.2 樣品的處理46
• 2.7.3 樣品檢測的結果判定46-47
• 2.8 膠體金試紙條的檢測47-48
• 2.8.1 膠體金試紙條的靈敏性試驗47
• 2.8.2 膠體金試紙條的特異性試驗47
• 2.8.3 膠體金試紙條的重復性試驗47
• 2.8.4 膠體金試紙條的保存期試驗47
• 2.8.5 臨床樣品的檢測47-48
• 3. 結果48-56
• 3.1 膠體金溶液質量鑒定48
• 3.2 膠體金標記抗DHAV-1單抗復合物的鑒定48-49
• 3.3 金標抗體的優(yōu)化49-50
• 3.3.1 膠體金最佳標記K_2CO_3的量的確定49
• 3.3.2 膠體金最佳標記蛋白量49-50
• 3.4 試紙條的優(yōu)化50-52
• 3.4.1 C線濃度的優(yōu)化50
• 3.4.2 金標抗體濃度的優(yōu)化50-51
• 3.4.3 T線濃度優(yōu)化51
• 3.4.4 NC膜的選擇51
• 3.4.5 玻璃纖維素膜的選擇51-52
• 3.4.6 樣品墊的選擇52
• 3.4.7 NC膜封閉時間的確定52
• 3.5 膠體金試紙條的檢測52-56
• 3.5.1 重復性52
• 3.5.2 特異性52-53
• 3.5.3 穩(wěn)定性53-54
• 3.5.4 靈敏度54-55
• 3.5.5 臨床樣本的檢測55-56
• 4. 討論56-61
• 4.1 膠體金試紙條的優(yōu)化57-58
• 4.1.1 抗體的選擇57
• 4.1.2 NC膜的優(yōu)化57-58
• 4.1.3 金標的優(yōu)化58
• 4.2 膠體金試紙條性能的檢測58-59
• 4.3 臨床樣本的檢測59-61
• 結論61-62
• 參考文獻62-68
• 致謝68

【參考文獻】

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本文編號：292213