發(fā)布時(shí)間：2017-04-07 22:09

  本文關(guān)鍵詞：鵝TLR7和TLR21抗病毒免疫學(xué)特性及功能初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Toll樣受體作為一種重要的模式識(shí)別受體,能夠識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式。大量研究報(bào)道表明,禽類(lèi)的TLR3、TLR7與TLR21參與機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。水禽鵝,作為許多病原的天然宿主,其抗病毒免疫反應(yīng)值得做深入研究。本研究首次對(duì)鵝TLR7 (GoTLR7)與鵝TLR21 (GoTLR21)的抗病毒免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。通過(guò)使用低致病性禽流感病毒(H9N2)與鵝細(xì)小病毒(GPV)對(duì)3日齡雛鵝進(jìn)行人工感染,檢測(cè)其主要免疫器官及其他相關(guān)器官發(fā)現(xiàn)：在感染H9N2病毒后的第3天到第7天,GoTLR7在肺組織的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,特別是在第7天其表達(dá)量上調(diào)了約5倍,但在第一天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異；在小腸組織中,兩組之間GoTLR21與GoTLR7表達(dá)量均無(wú)顯著差異。RIG-I受體作為另外一種非常重要的模式識(shí)別受體,負(fù)責(zé)識(shí)別病毒的特定RNA。在H9N2感染第3天鵝的肺和小腸組織中GoRIG-I表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。在H9N2感染過(guò)程中,干擾素誘導(dǎo)小分子(MX,OAS, PKR)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律：MX在所有組織中均無(wú)顯著變化；OAS在法氏囊、哈氏腺與肺組織的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；PKR在肺組織表達(dá)量顯著上調(diào),但其在胸腺組織顯著下調(diào)。GPV感染雛鵝后：GoTLR7在所有組織均無(wú)顯著變化；GoTLR21在脾臟和胸腺顯著升高,而在其他組織并無(wú)顯著變化；干擾素誘導(dǎo)的抗病毒小分子OAS在小腸組織表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,而在其他組織無(wú)顯著變化；GoRIG-I、GoMX與GoPKR在各組織的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。因此,結(jié)果表明GoTLR7與GoRIG-I參與宿主的抗H9N2流感病毒感染的免疫反應(yīng),并誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。GoTLR21參與宿主抗GPV病毒感染的免疫反應(yīng),誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。此外,我們還建立了體外感染模型,分別使用H9N2與GPV刺激鵝外周血單核細(xì)胞。用定量RT-PCR的方法檢測(cè)H9N2感染8h時(shí)GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控干擾素誘導(dǎo)小分子MX、OAS與PKR水平,結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組GoTLR7與GoRIG-I的表達(dá)量顯著性升高,而GoTLR21無(wú)任何變化；干擾素誘導(dǎo)小分子MX呈現(xiàn)顯著下降,而OAS與PKR均表現(xiàn)出顯著上升。用定量RT-PCR的方法檢測(cè)GPV感染8h時(shí)GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控干擾素誘導(dǎo)小分子MX、OAS與PKR水平,結(jié)果顯示：GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控MX、OAS與PKR轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明GoTLR7與GoRIG-I在體外參與了抗H9N2流感病毒感染的免疫反應(yīng),并誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。GPV感染PBMC后,GoTLR21與其他免疫相關(guān)基因均無(wú)顯著性變化,我們猜測(cè)可能是由于GPV病毒需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能引起TLR21受體的識(shí)別,從而產(chǎn)生抗病毒因子,本實(shí)驗(yàn)作用時(shí)間為8小時(shí)不能有效的誘導(dǎo)宿主經(jīng)由TLR21的抗病毒反應(yīng)。為了進(jìn)一步探討GoTLR7與GoTLR21是否具有抗病毒免疫學(xué)活性,我們構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7與pDs-Red1-N1-GoTLR21并轉(zhuǎn)染傳代雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)10h,然后孵育新城疫病毒(New castle disease virus, NDV),經(jīng)絕對(duì)定量PCR反應(yīng)及病毒滴度檢測(cè)而觀察轉(zhuǎn)染GoTLR7與GoTLR21質(zhì)粒是否對(duì)DF-1細(xì)胞中NDV的增殖或復(fù)制存在影響。GoTLR7與GoTLR21真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,而后孵育NDV病毒,研究結(jié)果顯示：孵育NDV病毒12h后轉(zhuǎn)染有GoTLR7細(xì)胞中NDV的復(fù)制受到顯著的抑制,而轉(zhuǎn)染GoTLR21并未對(duì)病毒增殖造成影響；孵育NDV病毒24h時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的病毒拷貝數(shù)均有所上升,但是轉(zhuǎn)染GoTLR7組中NDV拷貝數(shù)及TCIDso數(shù)值均顯著低于對(duì)照組,而轉(zhuǎn)染GoTLR21組中病毒增殖情況與對(duì)照組比較仍無(wú)顯著差異。因此,本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證GoTLR7參與抗RNA病毒免疫反應(yīng),并能抑制RNA病毒NDV的復(fù)制,而GoTLR21并不參與此反應(yīng)。大量研究表明哺乳動(dòng)物抗病毒TLR分布于細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體。為了驗(yàn)證禽類(lèi)抗病毒TLR的細(xì)胞分布,我們將真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF與BHK21。24h后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)GoTLR7在DF-1、BHK21與GEF上的細(xì)胞定位不同,具體表現(xiàn)為：DF-1和BHK21細(xì)胞中GoTLR7熒光信號(hào)集中分布于細(xì)胞核一側(cè),呈現(xiàn)極化狀態(tài)；而GEF細(xì)胞上GoTLR7熒光信號(hào)圍繞分布于細(xì)胞核周?chē)?非分布于細(xì)胞核一側(cè)。我們分別采集PEGFP-C1-GoTLR7轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞24h、48h與72h時(shí)的圖片發(fā)現(xiàn)：GoTLR7的細(xì)胞定位隨表達(dá)時(shí)間發(fā)生了變化,具體表現(xiàn)為：24h時(shí),GoTLR7分布于細(xì)胞核的一側(cè),而在48h及72h, GoTLR7綠色熒光集中分布于遠(yuǎn)離細(xì)胞核的胞質(zhì)內(nèi),呈現(xiàn)球形,推測(cè)其定位于某細(xì)胞器。將真核表達(dá)質(zhì)粒pDs-Redl-N1-GoTLR21分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF、MDCK與BHK21。24h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞類(lèi)型上GoTLR21分布特征一致,均表現(xiàn)為緊緊圍繞于細(xì)胞核周?chē)�。分別采集pDs-Red1-N1-GoTLR21轉(zhuǎn)染BHK21 24h、48h與72h的圖片發(fā)現(xiàn),GoTLR21的細(xì)胞定位隨表達(dá)時(shí)間也發(fā)生了變化。具體表現(xiàn)為：轉(zhuǎn)染24h時(shí),GoTLR21紅色熒光表現(xiàn)為緊緊圍繞細(xì)胞核周?chē)?呈現(xiàn)圓圈狀特征,而在48h時(shí)發(fā)現(xiàn)其濃縮為圓點(diǎn)狀,且遠(yuǎn)離細(xì)胞核分布,到72h時(shí)其形狀再次變?yōu)榄h(huán)形。因此,我們推測(cè)GoTLR7與GoTLR21也定位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器上,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者核內(nèi)體上。綜上,本研究為鵝抗病毒TLR的抗病毒免疫學(xué)特性及生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ),為研發(fā)新型佐劑及抗病毒生物制劑提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：GoTLR7 GoTLR21 細(xì)胞定位 抗病毒免疫學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.33
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-19
• 1 TLR7與TLR21的免疫學(xué)與生物學(xué)特點(diǎn)13-15
• 2 TLR7與TLR21抗病毒免疫學(xué)特性及細(xì)胞定位研究15-17
• 2.1 Toll樣受體抗病毒相關(guān)免疫學(xué)特性研究進(jìn)展15-17
• 2.2 TLR7與TLR21的細(xì)胞定位研究進(jìn)展17
• 3 本實(shí)驗(yàn)的研究目的及意義17-19
• 第二部分 試驗(yàn)研究19-54
• 第一章 H9N2與GPV對(duì)雛鵝先天性免疫基因的影響19-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與毒株20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備20
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2 實(shí)驗(yàn)操作方法與步驟21-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理21
• 2.2 組織處理及RNA提取21-22
• 2.3 引物設(shè)計(jì)及RT-PCR實(shí)驗(yàn)原理22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-27
• 3.1 H9N2病毒感染雛鵝引起的TLRs等相關(guān)免疫基因的表達(dá)量變化23-25
• 3.2 GPV病毒感染雛鵝引起的TLRs等相關(guān)免疫基因的表達(dá)量變化25-27
• 4 討論27-28
• 5 本章小結(jié)28-29
• 第二章 H9N2與GPV對(duì)鵝外周血單核細(xì)胞先天免疫基因的影響29-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及毒株29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備29
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑29-30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法與操作30-31
• 2.1 鵝外周血單核細(xì)胞的分離及病毒感染30-31
• 2.2 RNA的提取及引物設(shè)計(jì)31
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-33
• 3.1 H9N2低致病性禽流感感染鵝外周血單核細(xì)胞31-32
• 3.2 鵝細(xì)小病毒GPV感染鵝外周血單核細(xì)胞32-33
• 4 討論33-34
• 4.1 H9N2對(duì)鵝外周血單核細(xì)胞先天免疫分子的影響33-34
• 4.2 GPV對(duì)鵝外周血單核細(xì)胞先天免疫分子的影響34
• 5 本章小結(jié)34-35
• 第三章 GoTLR7與GoTLR21的抗NDV病毒活性初探35-45
• 1 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)毒株與細(xì)胞35
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備35
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑35-36
• 1.4 相關(guān)溶液的配制36-37
• 1.5 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制作37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法與操作37-41
• 2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7的構(gòu)建37-38
• 2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pDs-Red1-N1-GoTLR21的構(gòu)建38-39
• 2.3 NDV病毒感染DF-1細(xì)胞步驟39-40
• 2.4 NDV拷貝數(shù)絕對(duì)定量檢測(cè)方法的建立40-41
• 2.5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的NDV在DF-1細(xì)胞上的拷貝數(shù)與TCID_(50)的測(cè)定41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-43
• 3.1 NDV標(biāo)準(zhǔn)曲線41-42
• 3.2 瞬時(shí)過(guò)表達(dá)GoTLR7與GoTLR21對(duì)NDV拷貝數(shù)的影響42
• 3.3 瞬時(shí)過(guò)表達(dá)GoTLR7與GoTLR21對(duì)NDV TCID_(50)的影響42-43
• 4 討論43-44
• 5 本章小結(jié)44-45
• 第四章 鵝TLR7和TLR21的細(xì)胞定位研究45-54
• 1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與細(xì)胞45
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備45-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法與操作46-49
• 2.1 GoTLR7細(xì)胞定位研究的實(shí)驗(yàn)方法與步驟46-48
• 2.2 GoTLR21細(xì)胞定位研究的方法與步驟48-49
• 3 試驗(yàn)結(jié)果49-52
• 3.1 GoTLR7在不同細(xì)胞類(lèi)型上的細(xì)胞定位49
• 3.2 GoTLR7細(xì)胞定位隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的變化49-50
• 3.3 GoTLR21在不同細(xì)胞類(lèi)型上的細(xì)胞定位50-51
• 3.4 GoTLR21細(xì)胞定位隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的變化51-52
• 4 討論52-53
• 5 本章小結(jié)53-54
• 第三部分 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 作者簡(jiǎn)介及發(fā)表論文情況60
• 作者基本情況60
• 發(fā)表論文情況60

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本文編號(hào)：291421