隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展,CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸成為主流。為了驗(yàn)證CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞基因組上的切割效率,在雞肌肉生長抑制素（Myostatin,MSTN）基因第1、第2外顯子上各自篩選了5個(gè)Cas9靶點(diǎn),構(gòu)建p X330-sg RNA表達(dá)載體;將GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入DF-1細(xì)胞,通過檢測(cè)表達(dá)GFP細(xì)胞的比例來優(yōu)化電轉(zhuǎn)程序;將載體用優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)程序電轉(zhuǎn)入DF-1細(xì)胞,培養(yǎng)72 h;最后收集細(xì)胞提取基因組,通過T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ（T7EⅠ）酶切試驗(yàn),選出具有Cas9切割效率的靶點(diǎn)片段,將該片段連入p MD19-T載體,測(cè)序并分析結(jié)果。結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以成功對(duì)DF-1細(xì)胞基因組進(jìn)行切割并引入突變,其中1號(hào)外顯子上4號(hào)靶點(diǎn)的突變率為64.3%,2號(hào)外顯子上2號(hào)靶點(diǎn)的突變率為23.3%。研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在DF-1細(xì)胞中可以有效切割基因組,為CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于雞的基因組編輯提供科學(xué)依據(jù)。 

【文章來源】：中國家禽. 2016年07期 北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1.材料與方法
    1.1試驗(yàn)材料
    1.2試驗(yàn)方法
        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.2.2 細(xì)胞電轉(zhuǎn)
        1.2.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR
        1.2.5 載體構(gòu)建
        1.2.6 連接反應(yīng)
        1.2.7 轉(zhuǎn)化
        1.2.8 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
        1.2.9 細(xì)胞基因組提取
        1.2.10 T7 Endonuclease Ⅰ（T7EⅠ）酶切
2 結(jié)果與分析
    2.1 電轉(zhuǎn)程序選擇
    2.2 Cas9切割效率驗(yàn)證
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)構(gòu)建DDX21基因敲除模型及功能初步研究[D]. 魯國濤.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]應(yīng)用CRISPR/Cas9及超表達(dá)技術(shù)研究miR-2954和YY1在雞睪丸支持細(xì)胞調(diào)控精子發(fā)育中的作用[D]. 喬凌云.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[3]AAV-SaCas9-sgRNA腺相關(guān)病毒的包裝及其對(duì)Balb-c小鼠MSTN基因的敲除[D]. 王娟.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[4]MSTN基因敲除灘羊的制備與評(píng)價(jià)[D]. 丁毅.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2019
[5]煙草響應(yīng)低溫脅迫的生化與分子基礎(chǔ)及TCP基因編輯突變的初步研究[D]. 肖玉潔.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[6]CRISPR/Cas9介導(dǎo)雞肌肉生長和黑色素合成相關(guān)基因敲除研究[D]. 尹亞軍.陜西理工大學(xué) 2017
[7]CPED1基因在雞胚胎干細(xì)胞向精原干細(xì)胞分化過程中的作用[D]. 王飛.揚(yáng)州大學(xué) 2017



本文編號(hào)：2917300