本文關(guān)鍵詞：2株H5N6亞型禽流感病毒的序列分析和致病性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自2014年5月四川省第一次報(bào)道人感染H5N6亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以來(lái),云南和廣東省相繼報(bào)道H5N6高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI)感染人的事件。由于廣東省和四川省兩省間隔距離較遠(yuǎn),家禽和人感染H5N6的來(lái)源、致病性以及傳播引起了公眾的高度關(guān)注。在2014-2015年期間,本研究室在廣東省內(nèi)野鳥(niǎo)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)過(guò)程中,從鵲鴝和毛腿沙雞上分離到2株新型的H5N6病毒,分別命名為A/Pallas's Sandgrouse/Guangdong/ZH283/2015和A/Oriental Magpie-robin/Guangdong/SW8/2014。基因和進(jìn)化樹(shù)表明,2株AIV由多個(gè)不同來(lái)源的毒株的基因片段重組而成。HA基因?qū)儆贖5N1亞型,進(jìn)化分支屬2.3.4.4,NA基因則與歐亞家禽源的H6N6亞型相同,位于ST192-like分支;ZH283與感染人的H5N6病毒(A/Guangdong/ZQ874/2015)高度同源,SW8與另外分離的感染人的H5N6病毒(A/Guangzhou/39715/2014)高度同源,表明感染人的H5N6可能來(lái)源于野鳥(niǎo)毒株的片段重組。對(duì)全基因序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn),2株毒株的HA的裂解位點(diǎn)均是-RRRKR↓G-,含有4個(gè)堿性氨基酸,裂解位點(diǎn)符合高致病性禽流感病毒典型分子特征,且ZH283的HA蛋白的I155T受體結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)門(mén),分子特性表明ZH283對(duì)人源受體有一定的親和關(guān)系。2個(gè)毒株的PB2蛋白在E627K和D701N這兩個(gè)位點(diǎn)都沒(méi)有突變,NP蛋白A184K突變,NS1蛋白的D92E也均發(fā)生了突變。為了研究這2株H5N6亞型AIV的生物學(xué)特性,本文對(duì)這2株毒住進(jìn)行了SPF雞、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鴨和鵪鶉的致病性試驗(yàn)。SPF雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,2株H5N6對(duì)SPF雞高度致死并引起組織器官感染,在肺臟、氣管和法氏囊等10個(gè)臟器中均能檢測(cè)到較高的病毒滴度,ZH283組被檢的10個(gè)臟器中的病毒滴度都達(dá)到7.83log_(10)EID_(50)/g以上,肺的滴度較高,達(dá)10.08 log_(10)EID_(50)/g;在SW8組被檢的10個(gè)臟器中,log_(10)EID_(50)/g值在5.58~7.58范圍內(nèi),較高是法氏囊和胰腺,較低是心臟;感染組和同居組的SPF雞均可經(jīng)咽喉和泄殖腔排毒。BABL/C小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,2株毒株對(duì)小鼠都具有高致病性與高致死率,致死率均為100%;感染病毒后的小鼠體重均有下降,ZH283組下降率達(dá)到23%,SW8組下降率為12.7%;ZH283和SW8在小鼠體內(nèi)復(fù)制的病毒滴度也較高,特別是肺臟,第5 d分別高達(dá)10.00 log_(10)EID_(50)/g和9.5 log_(10)EID_(50)/g。豚鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,2株病毒感染豚鼠后在鼻甲骨、氣管和肺臟等8個(gè)組織臟器中均能檢測(cè)到病毒的復(fù)制,log_(10)EID_(50)/g值在3.75~6.42范圍內(nèi),其中鼻甲骨中復(fù)制能力較強(qiáng),ZH283組和SW8組分別為6.42 log_(10)EID_(50)/g和6.33 log_(10)EID_(50)/g,肺臟次之,ZH283組和SW8組分別為5.75 log_(10)EID_(50)/g和6.25 log_(10)EID_(50)/g。同時(shí)也能在豚鼠的鼻腔和泄殖腔中分離到病毒,同居組也均能在鼻腔和泄殖腔中分離到病毒。北京鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,在氣管、肺臟和腎等10個(gè)臟器中均能檢測(cè)到病毒的復(fù)制,感染組和同居組的鴨均可經(jīng)咽喉和泄殖腔向外排毒,檢測(cè)出同居組的鵪鶉向外排毒的病毒滴度比感染組和同居組的鴨子高;另一方面2個(gè)同居組的鵪鶉出現(xiàn)了較高的死亡率,ZH283鵪鶉同居組的死亡率為2/3,SW8鵪鶉同居組的死亡率為1/3。鵪鶉的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染組的鵪鶉致死率為100%,ZH283與SW8同居組的鵪鶉死亡率分別為2/3和1/3,同居組的鴨子則有較高的存活率,ZH283組與SW8組分別為2/3和3/3;在感染組的鵪鶉的盲腸扁桃體、肺臟和腎等9個(gè)組織臟器均能檢測(cè)到較高滴度病毒的復(fù)制,log_(10)EID_(50)/g值在7.25~9.5范圍內(nèi);感染組和同居組均能在口腔和泄殖腔拭子中分離到病毒。綜上所述,2株H5N6亞型AIV對(duì)SPF雞、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鴨和鵪鶉表現(xiàn)出不同的致病性,當(dāng)中以對(duì)SPF雞和BABL/C小鼠的致病性較強(qiáng),鵪鶉和豚鼠次之,對(duì)北京鴨不表現(xiàn)致病性。2株H5N6亞型AIV能經(jīng)感染的北京鴨傳播到鵪鶉,也能從感染的鵪鶉傳播到北京鴨。本文中重組的H5N6亞型AIV從廣東省內(nèi)的野鳥(niǎo)分離而得,提示野鳥(niǎo)能夠感染、攜帶H5N6,并且隨其遷徙將H5N6傳播至其他地方,進(jìn)而感染更多的野鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物,對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了潛在的威脅,值得高度關(guān)注。
【關(guān)鍵詞】：高致病性禽流感 H5N6 基因序列 致病性 傳播
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 常用英文縮略表8-13
• 1 前言13-16
• 1.1 禽流感概述13
• 1.2 禽流感病毒病原學(xué)特點(diǎn)13-14
• 1.3 H5N6亞型禽流感14-15
• 1.3.1 H5亞型AIV的流行狀況與遺傳變異14
• 1.3.2 H5N6亞型AIV及抗原變異14-15
• 1.3.3 H5N6亞型AIV的公共衛(wèi)生學(xué)意義15
• 1.4 本研究的目的與意義15-16
• 2 材料16-18
• 2.1 病料和毒株背景16
• 2.2 雞胚、試驗(yàn)動(dòng)物和菌種16
• 2.3 主要儀器設(shè)備16
• 2.4 主要試劑和分子生物學(xué)材料16-17
• 2.5 分子生物學(xué)軟件17-18
• 3 方法18-27
• 3.1 H5N6病毒的分離18
• 3.2 H5N6亞型AIV HA、NA基因的分子生物學(xué)鑒定18-20
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)18
• 3.2.2 H5N6亞型AIV的RNA提取18-19
• 3.2.3 H5N6亞型AIV的c DNA合成19-20
• 3.3 H5N6亞型AIV的有限稀釋法純化20
• 3.4 雞胚半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定20
• 3.5 H5N6亞型AIV的全基因序列擴(kuò)增20-24
• 3.5.1 引物設(shè)計(jì)20-21
• 3.5.2 H5N6亞型AIV的RNA提取21
• 3.5.3 H5N6亞型AIV的c DNA合成21
• 3.5.4 H5N6亞型AIV全基因的PCR擴(kuò)增21-22
• 3.5.5 目的片段的檢測(cè)22
• 3.5.6 PCR擴(kuò)增結(jié)果的回收及純化22
• 3.5.7 目的片段與PGEM-T載體的連接與轉(zhuǎn)化22-23
• 3.5.8 篩選與鑒定陽(yáng)性菌落23
• 3.5.9 各目的片段序列的測(cè)定與拼接23-24
• 3.6 2 株H5N6亞型AIV對(duì)SPF雞的致病性試驗(yàn)24-25
• 3.6.1 2 株H5N6亞型的AIV在SPF雞體內(nèi)復(fù)制情況24
• 3.6.2 2 株H5N6亞型AIV感染SPF雞后排毒情況24-25
• 3.7 2 株H5N6亞型AIV對(duì)BABL/C小鼠的致病性試驗(yàn)25
• 3.7.1 2 株H5N6亞型的AIV在小鼠體內(nèi)復(fù)制情況25
• 3.8 2 株H5N6亞型AIV對(duì)豚鼠的致病性試驗(yàn)25-26
• 3.8.1 2 株H5N6亞型的AIV在豚鼠體內(nèi)復(fù)制情況26
• 3.8.2 2 株H5N6亞型AIV感染豚鼠后排毒情況26
• 3.9 2 株H5N6亞型AIV對(duì)北京鴨的致病性與跨種傳播試驗(yàn)26-27
• 3.9.1 2 株H5N6亞型的AIV在北京鴨體內(nèi)復(fù)制情況26
• 3.9.2 2 株H5N6亞型AIV感染北京鴨和鵪鶉后的排毒情況26-27
• 3.10 2 株H5N6亞型AIV對(duì)鵪鶉的致病性與跨種傳播試驗(yàn)27
• 3.10.1 2 株H5N6亞型的AIV在鵪鶉體內(nèi)復(fù)制情況27
• 3.10.2 2 株H5N6亞型AIV感染北京鴨后排毒情況27
• 4 結(jié)果與分析27-54
• 4.1 毒株的初步分離鑒定結(jié)果27-28
• 4.2 毒株的HA、NA基因的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果28
• 4.3 H5N6亞型AIV純化的結(jié)果28
• 4.4 雞胚半數(shù)感染量（EID50）測(cè)定結(jié)果28
• 4.5 H5N6亞型AIV的全基因序列及分析結(jié)果28-41
• 4.5.1 HA基因序列分析28-29
• 4.5.2 NA基因序列分析29-30
• 4.5.3 PB2基因序列分析30-34
• 4.5.4 PB1基因序列分析34
• 4.5.5 PA基因序列分析34-40
• 4.5.6 NP基因序列分析40
• 4.5.7 M基因序列分析40-41
• 4.5.8 NS基因序列分析41
• 4.6 2 株H5N6亞型AIV對(duì)SPF雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果41-42
• 4.6.1 2 株H5N6亞型AIV感染SPF雞后的存活情況41
• 4.6.2 2 株H5N6亞型AIV在SPF雞體內(nèi)的復(fù)制情況41-42
• 4.6.3 SPF雞感染后口咽和泄殖腔的排毒情況42
• 4.6.4 14 d后存活的SPF雞血清抗體測(cè)定結(jié)果42
• 4.7 2 株H5N6亞型AIV對(duì)BABL/C小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果42-44
• 4.7.1 2 株H5N6亞型AIV感染SPF BALB/C小鼠后的存活情況42-43
• 4.7.2 2 株H5N6亞型AIV感染SPF BALB/C小鼠后體重變化情況43-44
• 4.7.3 2 株H5N6亞型AIV在SPF BALB/C小鼠體內(nèi)復(fù)制情況44
• 4.8 2 株H5N6亞型AIV對(duì)豚鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果44-46
• 4.8.1 2 株H5N6亞型AIV感染豚鼠后的存活情況44-45
• 4.8.2 2 株H5N6亞型AIV在豚鼠體內(nèi)的復(fù)制情況45
• 4.8.3 豚鼠感染后鼻腔和泄殖腔的排毒情況45-46
• 4.8.4 14 d后存活的豚鼠血清抗體測(cè)定結(jié)果46
• 4.9 2 株H5N6亞型AIV對(duì)北京鴨的致病性與跨種傳播試驗(yàn)結(jié)果46-47
• 4.9.1 2 株H5N6亞型AIV感染北京鴨后的存活情況46
• 4.9.2 2 株H5N6亞型AIV在北京鴨體內(nèi)的復(fù)制情況46-47
• 4.9.3 北京鴨感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情況47
• 4.9.4 14 d后存活的北京鴨和鵪鶉的血清抗體測(cè)定結(jié)果47
• 4.10 2 株H5N6亞型AIV對(duì)鵪鶉的致病性與跨種傳播試驗(yàn)結(jié)果47-54
• 4.10.1 2 株H5N6亞型AIV感染鵪鶉后的存活情況47-48
• 4.10.2 2 株H5N6亞型AIV在鵪鶉體內(nèi)的復(fù)制情況48
• 4.10.3 鵪鶉感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情況48-49
• 4.10.4 14 d后存活的鵪鶉和北京鴨的血清抗體測(cè)定結(jié)果49-54
• 5 討論54-58
• 全文總結(jié)58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄：攻讀碩士學(xué)位期間的科研成果64

  本文關(guān)鍵詞：2株H5N6亞型禽流感病毒的序列分析和致病性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：291046