豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是當(dāng)前我國(guó)廣泛流行的豬傳染性疾病,是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV-2)引起的。其中斷奶仔豬最易感,臨床表現(xiàn)多以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)為特點(diǎn),給我國(guó)乃至世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。PCV-2引起的豬圓環(huán)病毒病目前尚無(wú)有效的治療措施,而且PCV-2對(duì)外界抵抗力強(qiáng),豬場(chǎng)凈化難度高。疫苗接種仍然當(dāng)前防控該病的最有效的手段之一。由于性能穩(wěn)定、安全性高,滅活疫苗是當(dāng)前主要的疫苗研發(fā)類(lèi)型,雖然商業(yè)化的滅活疫苗已在世界各地養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛的應(yīng)用,但其綜合免疫效果仍有待提高。本研究首先對(duì)PCV-2YZ分離株的繁殖滴度、特異性、毒力、免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià);隨后確立了豬圓環(huán)病毒2型YZ株的最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件;進(jìn)一步建立了 PCV-2YZ株的種子批并完成了各項(xiàng)鑒定;最后篩選和優(yōu)化疫苗劑型和免疫佐劑,為研制出安全高效的PCV-2滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。1.豬圓環(huán)病毒2型YZ株生物學(xué)特性研究為研究PCV-2 F1代病毒的生物學(xué)特性,采用間接免疫熒光法(Indirect fluorescence assay,IFA)測(cè)定病毒繁殖滴度,中和試驗(yàn)測(cè)定病毒特異性,PCR方法和免疫組化(immunohistochemistry,IHC)試驗(yàn)測(cè)定病毒感染的毒力,進(jìn)一步通過(guò)免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)該毒株的免疫原性。結(jié)果顯示:PCV-2YZ株F1代病毒效價(jià)為105.48TCID50/ml,并可與PCV-2陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),中和后感染細(xì)胞未見(jiàn)熒光:用F1代病毒對(duì)3～5周齡健康易感仔豬肌肉注射和滴鼻病毒液各2.0 ml/頭,可使仔豬(5/5)全部發(fā)病,出現(xiàn)典型的PCV-2感染相關(guān)臨床癥狀及病理變化;將PCV-2F1代毒株制備滅活疫苗,并對(duì)健康仔豬(3～5周齡)進(jìn)行免疫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在二免后2 w,該疫苗不僅能提高仔豬體液免疫水平,誘導(dǎo)高效特異性抗體產(chǎn)生,而且能夠有效抵抗3株不同來(lái)源流行株的攻擊,保護(hù)率可達(dá)100%。以上試驗(yàn)結(jié)果表明:PCV-2YZ株F1代各項(xiàng)生物學(xué)特性穩(wěn)定,而且該侯選株對(duì)目前的流行毒株具有良好的保護(hù)效力,可以作為疫苗株開(kāi)展進(jìn)一步的應(yīng)用。2.豬圓環(huán)病毒2型YZ株最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)通過(guò)對(duì)D-氨基葡萄糖濃度、接毒時(shí)細(xì)胞密度、接種方式、接毒劑量、收毒時(shí)間以及收毒方法等一系列條件進(jìn)行優(yōu)化,采用間接免疫熒光方法檢測(cè)病毒滴度,篩選出最佳PCV-2增殖條件。結(jié)果顯示:以2-4 mmol/LD-氨基葡萄糖加入維持液,待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后按培養(yǎng)液10%的量接毒,37℃培養(yǎng)72 h,細(xì)胞及細(xì)胞液一起反復(fù)凍融后收獲,獲得的病毒滴度高,能達(dá)到105.50 TCID50/ml以上。采用上述最優(yōu)培養(yǎng)條件分別在扁瓶和轉(zhuǎn)瓶上對(duì)PCV-2的培養(yǎng)進(jìn)行驗(yàn)證,取PCV-2 YZ株F1代病毒連續(xù)傳5代后分別測(cè)其毒價(jià),病毒含量仍不低于105.50 TCID50/ml,證明最佳培養(yǎng)條件可用于工廠化生產(chǎn)。3.豬圓環(huán)病毒2型YZ株種子批的建立及鑒定研究為了建立PCV-2(PCV-2)YZ株種子批,將PCV-2 YZ株F1代種毒,在PK-15細(xì)胞上連傳至30代后分別測(cè)定各代次病毒液的TCID50。經(jīng)測(cè)定各代次病毒液效價(jià)均穩(wěn)定在105.0 TCID50/ml以上,且無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染;PCV-2陽(yáng)性血清均能與PCV-2 YZ株F1、F10、F25、F30代病毒液發(fā)生較好的特異性中和反應(yīng);各代病毒液經(jīng)傳代后其免疫原性沒(méi)有發(fā)生改變,具有良好的穩(wěn)定性,根據(jù)以上結(jié)果確定PCV-2YZ株種毒基礎(chǔ)種子批代次為F21代～F25代;生產(chǎn)種子批代次為F26代～F28代,連續(xù)繼代不超過(guò)3代。選擇F5-F10代病毒液測(cè)定其毒力,以確立強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)對(duì)各代次病毒液的純凈性、特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示:F5-F8代病毒液具有較強(qiáng)的致病性,可導(dǎo)致4/5頭以上攻毒仔豬發(fā)病,而F9、F10代病毒液致病性則相對(duì)減弱,因此強(qiáng)毒代次定為F5-F8代。4.不同佐劑及劑型的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備及免疫效力評(píng)價(jià)選用不同免疫佐劑,同時(shí)配合不同劑型,制備PCV-2滅活疫苗(YZ株),隨后免疫仔豬后評(píng)價(jià)各疫苗的免疫效力。制備的滅活疫苗包括:選用10號(hào)白油制備油包水(W/O)劑型疫苗;選用ISA206VG佐劑(MontanideTM),制備水包油包水(W/O/W)劑型疫苗;分別選用ISA 15A VG和ISA35 VG佐劑(MontanideTM),制備水包油劑型(O/W)劑型疫苗;選用IMS251CVG佐劑(MontanideTM),制備水(W)劑型疫苗。除白油組外,其余4組疫苗安全性較好。5組疫苗免疫效力試驗(yàn)表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗組首免后2 w和3wPCV-2IFA抗體水平顯著高于白油(W/O)和IMS251CVG(W)疫苗組(P0.05);攻毒后豬血清中病毒PCR檢測(cè),ISA206VG(W/O/W)疫苗組14d均為陰性,其他免疫組21～28 d轉(zhuǎn)為陰性;豬淋巴結(jié)免疫組化檢測(cè),ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗組均未出現(xiàn)PCV-2陽(yáng)性,且該兩組中仔豬均未出現(xiàn)連續(xù)2d以上的高熱癥狀。以上結(jié)果表明,ISA206VG(W/O/W)PCV2滅活疫苗(YZ株)對(duì)仔豬具有較好的綜合免疫保護(hù)效力,可進(jìn)行后續(xù)的臨床擴(kuò)大試驗(yàn)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S852.4
【部分圖文】：

使遺傳物質(zhì)得到高效的利用，在ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ之間是表現(xiàn)為相互緊密的重疊排列［３５］。一??定程度上，ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８之間的保守性較高，相比之下，??其余的ＯＲＦｓ保守性卻很低（如圖１）?％。通過(guò)分析ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ發(fā)現(xiàn)，其主要的閱讀??框分別是ＯＲＦ１和ＯＲＦ２，大小均＞６００?ｂｐ［３７］。此外，通過(guò)比較ＰＣＶ－１和ＰＣＶ－２的閱讀框發(fā)??現(xiàn)，二者的ＯＲＦ１相對(duì)較保守（核酸同源性為８３％；氨基酸同源性為８６％），而閱讀框ＯＲＦ２??

ＰＣＶ－２?ＹＺ株Ｆ１代病毒液可與ＰＣＶ－２陽(yáng)性血清發(fā)生特異性中和反應(yīng)，其中病毒中和試??驗(yàn)組和培養(yǎng)基空白對(duì)照組在熒光顯微鏡下均未見(jiàn)熒光，而未中和的病毒對(duì)照組則在熒光顯??微鏡下觀察到綠色熒光信號(hào)，結(jié)果表明該病毒具有良好的特異性（表１－２，圖１－１）。??■■??圖１－１?ＰＣＶ－２?ＹＺ?Ｆ１代ＩＦＡ試驗(yàn)結(jié)果??（１）感染對(duì)照組（２）中和試驗(yàn)組??Ｆｉｇ?１－１?ＩＦＡ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｆｒｏｍ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??（１）?Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（２）?Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｇｒｏｕｐ??表１－２?ＰＣＶ－２?ＹＺ株ＦＩ代病毒特異性檢測(cè)結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｏｆ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??特異性（綠色熒光信號(hào)）??病毒?中和組?陽(yáng)性組?陰性組??Ｆ１?＋??注：“＋”表示在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號(hào)表示在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光信號(hào)??２．３毒力測(cè)定??２．３．１?ＰＣＶ－２陰性豬的篩選??３？５ｗ健康仔豬血清ＰＣＲ檢測(cè)為陰性（圖１－２），ＩＦＡ抗體檢測(cè)也為陰性（圖卜３）。??

?３１??清晰看不到黃染顆粒物質(zhì)（圖１－６）。健康對(duì)照組未見(jiàn)上述病理變化。??聲』々？心??腎贓病變，腎乳失出ｉ?髂內(nèi)汫巴結(jié)庚深、腫大?眄系巴結(jié)腫大、出血??ＳＭ攻毒后豬各器官病變情況?．１備??Ｆｉｇ?１－４．?Ｔｈｅ?ｌｅｓｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎｓ?ａｆｔｅｒ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ??—．１：４．?：??圖１－５攻毒豬淋巴結(jié)病理切片（４００ｘ）??Ｆｉｇ?１－５．Ｔｈｅ?ｐａｔｈ
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2877733