【摘要】：禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)、馬立克病病毒(Marerk’s disease virus,MDV)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious butsal disease virus,IBDV)是引發(fā)家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)是引發(fā)家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于傳統(tǒng)的診斷檢測方法難以進行多病原或多病原型的聯(lián)合檢測,使生產(chǎn)上發(fā)生的同類型疫病短時間內(nèi)難以鑒別�？紤]到家禽疫病防控急需,基于上述六種病原的高通量同步檢測和部分病原同步分型檢測方法尚未見報道。本研究結(jié)合金標銀染顯色技術(shù),構(gòu)建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六種禽病毒病同步共檢基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型的同步共檢可視化基因芯片,對芯片的制備及檢測過程進行條件優(yōu)化,并對臨床初步應用進行評價。研究主要結(jié)果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共檢基因芯片構(gòu)建、檢測條件優(yōu)化和質(zhì)量評價1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共檢基因芯片構(gòu)建與檢測條件優(yōu)化。以ALV、MDV、IBDV的全基因組為模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,設計寡核苷酸探針,成功制備ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共檢基因芯片(簡稱共檢芯片Ⅰ)。對基因芯片的制備過程和檢測條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)寡核苷酸探針最優(yōu)使用濃度為50μmol/L,40℃條件下雜交2h,Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的使用濃度為4μg/mL,染色時間為5min,對陽性標本最終銀染顯色可見明顯檢測信號。2.對構(gòu)建的此基因芯片進行質(zhì)量評價。芯片檢測特異性試驗顯示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之間無交叉反應,特異性好,且以IBV為模板制備的PCR擴增標記不與共檢芯片Ⅰ雜交;敏感性試驗顯示,芯片的最低檢測濃度是1pg/μl。穩(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn),基因芯片能在常溫條件下進行有效保存不少于60 d,4℃條件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六種亞型聯(lián)合共檢可視化基因芯片的構(gòu)建、檢測條件優(yōu)化和質(zhì)量評價1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共檢基因芯片構(gòu)建與檢測條件優(yōu)化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因組,以及合成制備的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6個靶基因,并成功制備出H5-H7-H9-N1-N9-N2共檢基因芯片(簡稱共檢芯片Ⅱ);對基因芯片的制備過程和檢測條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)使用濃度為50μmol/L的寡核苷酸探針與含有生物素標記的靶基因PCR產(chǎn)物45℃條件下雜交2h,Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的最佳使用濃度為4μg/mL,銀染7min,陽性標本銀染顯色可見明顯的檢測信號。2.對構(gòu)建的此基因芯片進行質(zhì)量評價�；蛐酒奶禺愋栽囼烇@示芯片特異性高,無交叉反應,且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV為模板制備的PCR擴增標記不與共檢芯片Ⅱ雜交;敏感性試驗顯示芯片的敏感性好,H5和N1亞型芯片的最低檢測濃度是1×10~(-10)ng\ul,H7亞型芯片的最低檢測濃度是1×10~(-8)ng\ul,N9亞型檢測芯片的最低檢測濃度是1×10~(-7)ng\ul,H9和N2亞型芯片的最低檢測濃度是1×10~(-8)ng\ul,均不同程度的高于RT-PCR檢測技術(shù);穩(wěn)定性試驗顯示,本研究建立的可視化芯片4℃條件下可保存不少于90d。三、共檢芯片Ⅰ和共檢芯片Ⅱ的初步臨床應用將本研究構(gòu)建的兩套基因芯片對四川安岳、彭州、瀘州、廣元、自貢、樂山、廣漢、溫江、重慶、山東等地區(qū)疑似患禽白血病、馬立克病、傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫和傳染性喉氣管炎的155份臨床送檢樣品進行檢測,其中,六類禽病毒病基因芯片的檢測結(jié)果為ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的陽性檢出率分別為7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV為4.5%,NDV和AIV為2.5%,ALV、MDV和IBDV為0.6%,ALV、AIV和NDV為1.2%,該檢測方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR檢測方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型的同步共檢芯片的檢測結(jié)果為H5、H7、H9、N1、N9、N2的陽性檢出率分別為4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亞型檢出率為21.7%,H9N2亞型檢出率為4.3%,H5和H9亞型共同感染檢出率為4.3%,該檢測方法與RT-PCR方法相比,敏感性為100%,特異性高于92.8%,符合率高于95.6%,對二者結(jié)果進行差方檢驗的Kappa值均0.80,表明兩種檢測方法具有很好的一致性。綜上,本研究成功構(gòu)建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六種禽病毒病同步共檢基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型同步共檢基因芯片,兩種基因芯片具備較好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性,能有效應用于上述禽類疫病的臨床樣本檢測,為此類禽疫病的快速鑒別診檢提供了新的先進手段。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S855.3
【圖文】：

個為 NDV-F 基因，第四排前三個為 AIV-NP 基因, 第四排后三個為 ILTV-TK 基因，如圖 2-1。圖2-1 基因芯片矩陣設計圖Fig. 2-1 The design of DNA microarray2.2.5.2 可視化基因芯片探針的稀釋將點樣緩沖液和 ddH2O 按 1:4 的比例混勻，用以稀釋合成的寡核苷酸探針，調(diào)整其終濃度為 50μmol/L。吸取稀釋的寡核苷酸探針混合液 80μL 輕輕加至 384 孔板相應的孔中，每個孔代表一種靶基因的探針稀釋液，兩種靶基因的孔之間間隔兩個孔的位置，以免靶基因混合液之間污染（注意探針混合液在孔內(nèi)不能有氣泡）。將 384 孔板放于點樣儀相應的位置上。同時，將醛基玻片置于點樣儀的模塊上，在點樣之前，對點樣儀進行一次校正。2.2.5.3 可視化基因芯片點樣儀的校正打開電腦、點樣儀電源，點樣針裝入點樣儀相應的位置。電腦上打開晶芯 PersonalArrayer 16 操作軟件，自檢結(jié)束后進入設置界面，控制點樣儀內(nèi)環(huán)境濕度為 50 %以上，分別進行噴樣準備、玻片設置、點陣設置、樣品設置和清洗設置操作。在噴樣準備中，分別校正清洗位置、抽干位置、第一片玻片位置、預噴位置、樣品孔板 A24 孔位置、排空位置。玻片設置中 OX: 5.5mm

22圖2-2 靶基因鑒定結(jié)果M：2000bp DNALadder； 1：λ 定位基因； 2：ALV-ENV；3：MDV-MEQ；4：IBDV-VP2；5：NDV-F；6：ILTV-TK；7：AIV-NP；N：陰性對照Fig. 2-2 The identification results of target geneM: 2000bp DNA Ladder; 1: λ; 2: ALV-ENV; 3: MDV-MEQ;4: IBDV-VP2; 5: NDV-F; 6: ILTV-TK; 7: AIV-NP; N: Negative control2.3.2 基因芯片制備的初檢2.3.2.1 陽性定位基因的檢測以 λ 定位基因為模板進行靶基因擴增標記，將 λDNA 擴增產(chǎn)物與含 6 種禽病毒病探針的芯片進行雜交，銀染顯色，肉眼觀察試驗結(jié)果。結(jié)果顯示陽性質(zhì)控 λ 定位基因雜交斑點明顯可見，陰性對照和其它探針斑點沒有可見雜交斑點（圖 2-3）。表明本研究制備的醛基基片及陽性定位基因質(zhì)量可靠。2.3.2.2 共檢芯片全基因的檢測6 種禽病毒病 6 個探針基因的全部探針位點均可以看到明顯的雜交斑點，陽性對照斑點明顯，陰性對照沒有可見雜交斑點，表明制備的可視化共檢芯片、選用探針基因質(zhì)量可靠（圖 2-4）。

.3.3.1 噴樣次數(shù)優(yōu)化結(jié)果結(jié)果顯示，一次或兩次噴樣時，斑點信號差別不明顯，但當?shù)谌螄姌訒r，探針出現(xiàn)位移導致雜交信號連在一起，影響最終雜交結(jié)果的判定。且隨著噴樣次數(shù)的增加驗成本和時間增加。因此，選擇一次噴樣制備芯片（見圖 2-5）。
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本文編號：2876245