豬偽狂犬病(Porcine Pseudoraibies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)引起豬的一種急性傳染病,被認為是對生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟影響最大的豬病毒病之一。本文將中草藥鬼針草提取物從體外和體內(nèi)兩個方面探究其抗偽狂犬病毒的效果,并將其運用于斷奶仔豬初步觀察其抗病毒的作用及對生產(chǎn)和免疫性能的影響。1、采用水煮醇沉的方法獲得鬼針草的粗提物,利用細胞病變觀察和CCK-8細胞活力測定結合的方法研究其對PrV感染BHK-21細胞的影響。并通過間接免疫熒光(IFA)、實時熒光定量PCR和原位熒光細胞凋亡檢測法,初步探究其抗偽狂犬病毒的機制。結果表明,治療模式和直接殺病毒模式中,鬼針草粗提物10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL均能明顯改善PrV引起的BHK-21細胞病變和活力(p0.001),預防模式?jīng)]有明顯效果(p0.05)。實時熒光定量PCR、IFA及細胞凋亡檢測結果均表明鬼針草粗提物抗偽狂犬病毒的機制可能是通過抑制PrV gB基因和蛋白的表達,減少病毒感染誘導造成的細胞凋亡等方式起到保護細胞的作用。2、構建PrV感染小鼠模型,設空白對照組、鬼針草單方提取物低、中、高劑量組、鬼針草復方(鬼針草:甘草:絞股藍:紅車軸草=2:1:1:1)提取物低、中、高劑量組、病毒組和陽性對照組。灌胃7 d后給予小鼠皮下注射10 LD_(50)的病毒液,然后繼續(xù)給予小鼠灌胃,觀察攻毒后5 d內(nèi)小鼠的死亡情況和臨床癥狀。結果表明,鬼針草可降低死亡率,延遲小鼠的發(fā)病時間,改善小鼠發(fā)病時的臨床癥狀,且復方效果優(yōu)于單方。為進一步探討發(fā)酵鬼針草復方對小鼠攻毒的保護效果,設空白對照組、低、中、高劑量發(fā)酵鬼針草復方組、病毒組及陽性對照組,給予小鼠飼喂給藥,7 d后,小鼠皮下注射10 LD_(50)的病毒液,小鼠繼續(xù)飼喂給藥,觀察攻毒后5 d內(nèi)小鼠的死亡情況和臨床癥狀。結果表明,發(fā)酵鬼針草復方組的小鼠發(fā)病時臨床癥狀減輕,死亡時間延長,死亡率降低。3、將鬼針草微粉與其他中草藥組方發(fā)酵,將發(fā)酵后的產(chǎn)物作為添加劑以0.5%、1%、2%三個梯度添加于基礎日糧中給于斷奶仔豬飼喂,觀察給藥28 d期間斷奶仔豬的腹瀉率、生長狀態(tài)、記錄采食量和增重量;28 d后空腹采血,分離血清檢測總IgG、IFN-γ及偽狂犬病毒、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、藍耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)檢出率。結果表明,鬼針草與其他中草藥組方發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物能降低腹瀉率(P0.05),提高血清中總IgG的含量(P0.001),但對提高斷奶仔豬增重量及IFN-γ含量無明顯影響(P0.05);同時可降低同群仔豬血清中PRRSV的檢出率;由于偽狂犬病病毒血癥期較短,未能檢測出PrV病毒核酸。綜上,鬼針草具有一定的體外和體內(nèi)抗偽狂犬病毒活性作用,其配伍紅車軸草、絞股藍與甘草的復方發(fā)酵制劑可以降低斷奶仔豬腹瀉率和提高其免疫力。
【學位單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S853.74
【部分圖文】：

圖 2-1 鬼針草提取物處理 BHK-21 細胞存活率注：與細胞對照相比，***P<0.001；**P<0.01Figure 2-1 Survival rate of BHK-21 cell treated with BPENote: Compared with cell control, ***P<0.001; **P<0.01.3.2 PrV 的 TCID50測定結果表 2-4 PrV 的 TCID50測定和計算（Reed-Muench 法）Table 2-4 TCID50determination and calculation of PrV (Reed-Muench method)毒稀釋度細胞病變 累計孔數(shù)細胞孔數(shù) 病出現(xiàn)細胞病變不出現(xiàn)細胞病變出現(xiàn)細胞病變不出現(xiàn)細胞病變10-18 0 49 0 49 (410-28 0 41 0 41 (410-38 0 33 0 33 (310-48 0 25 0 25 (2

鬼針草抗偽狂犬病毒的作用研究圖 2-2 結果表明，與病毒組相比，2.5，5，10 mg/ml 鬼針草提取物和 0.5 mg/mL伐昔洛韋處理 BHK-21 細胞后感染 PrV，細胞存活率與病毒組相比均差異不顯著（P>0.05），說明鬼針草提取物及伐昔洛韋提前給藥后感染病毒的給藥方式不能有效保護 BHK-21 細胞免受 PrV 侵染造成活力下降或死亡。

圖 2-2 預防模式 BHK-21 細胞的存活率注：與細胞對照相比，***P<0.001；與病毒組相比，###P<0.001Figure 2-2 Survival rate of BHK-21 cell in the prevention modeNote: Compared with cell control, ***P<0.001; Compared with PrV, ###P<0.001.2 預防模式抗病毒檢測結果（CPE）圖 2-3 顯示病毒組和 2.5，5，10 mg/ml 鬼針草提取物及 0.5 mg/mL 伐昔的細胞病變無明顯差異，說明先用鬼針草提取物和伐昔洛韋處理 B不能有效保護其感染 PrV 并產(chǎn)生病變。
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本文編號：2876506