豬偽狂犬病(Porcine Pseudoraibies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)引起豬的一種急性傳染病,被認(rèn)為是對(duì)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)影響最大的豬病毒病之一。本文將中草藥鬼針草提取物從體外和體內(nèi)兩個(gè)方面探究其抗偽狂犬病毒的效果,并將其運(yùn)用于斷奶仔豬初步觀察其抗病毒的作用及對(duì)生產(chǎn)和免疫性能的影響。1、采用水煮醇沉的方法獲得鬼針草的粗提物,利用細(xì)胞病變觀察和CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)合的方法研究其對(duì)PrV感染BHK-21細(xì)胞的影響。并通過(guò)間接免疫熒光(IFA)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和原位熒光細(xì)胞凋亡檢測(cè)法,初步探究其抗偽狂犬病毒的機(jī)制。結(jié)果表明,治療模式和直接殺病毒模式中,鬼針草粗提物10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL均能明顯改善PrV引起的BHK-21細(xì)胞病變和活力(p0.001),預(yù)防模式?jīng)]有明顯效果(p0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、IFA及細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果均表明鬼針草粗提物抗偽狂犬病毒的機(jī)制可能是通過(guò)抑制PrV gB基因和蛋白的表達(dá),減少病毒感染誘導(dǎo)造成的細(xì)胞凋亡等方式起到保護(hù)細(xì)胞的作用。2、構(gòu)建PrV感染小鼠模型,設(shè)空白對(duì)照組、鬼針草單方提取物低、中、高劑量組、鬼針草復(fù)方(鬼針草:甘草:絞股藍(lán):紅車(chē)軸草=2:1:1:1)提取物低、中、高劑量組、病毒組和陽(yáng)性對(duì)照組。灌胃7 d后給予小鼠皮下注射10 LD_(50)的病毒液,然后繼續(xù)給予小鼠灌胃,觀察攻毒后5 d內(nèi)小鼠的死亡情況和臨床癥狀。結(jié)果表明,鬼針草可降低死亡率,延遲小鼠的發(fā)病時(shí)間,改善小鼠發(fā)病時(shí)的臨床癥狀,且復(fù)方效果優(yōu)于單方。為進(jìn)一步探討發(fā)酵鬼針草復(fù)方對(duì)小鼠攻毒的保護(hù)效果,設(shè)空白對(duì)照組、低、中、高劑量發(fā)酵鬼針草復(fù)方組、病毒組及陽(yáng)性對(duì)照組,給予小鼠飼喂給藥,7 d后,小鼠皮下注射10 LD_(50)的病毒液,小鼠繼續(xù)飼喂給藥,觀察攻毒后5 d內(nèi)小鼠的死亡情況和臨床癥狀。結(jié)果表明,發(fā)酵鬼針草復(fù)方組的小鼠發(fā)病時(shí)臨床癥狀減輕,死亡時(shí)間延長(zhǎng),死亡率降低。3、將鬼針草微粉與其他中草藥組方發(fā)酵,將發(fā)酵后的產(chǎn)物作為添加劑以0.5%、1%、2%三個(gè)梯度添加于基礎(chǔ)日糧中給于斷奶仔豬飼喂,觀察給藥28 d期間斷奶仔豬的腹瀉率、生長(zhǎng)狀態(tài)、記錄采食量和增重量;28 d后空腹采血,分離血清檢測(cè)總IgG、IFN-γ及偽狂犬病毒、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、藍(lán)耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)檢出率。結(jié)果表明,鬼針草與其他中草藥組方發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物能降低腹瀉率(P0.05),提高血清中總IgG的含量(P0.001),但對(duì)提高斷奶仔豬增重量及IFN-γ含量無(wú)明顯影響(P0.05);同時(shí)可降低同群仔豬血清中PRRSV的檢出率;由于偽狂犬病病毒血癥期較短,未能檢測(cè)出PrV病毒核酸。綜上,鬼針草具有一定的體外和體內(nèi)抗偽狂犬病毒活性作用,其配伍紅車(chē)軸草、絞股藍(lán)與甘草的復(fù)方發(fā)酵制劑可以降低斷奶仔豬腹瀉率和提高其免疫力。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S853.74
【部分圖文】：

圖 2-1 鬼針草提取物處理 BHK-21 細(xì)胞存活率注：與細(xì)胞對(duì)照相比，***P<0.001；**P<0.01Figure 2-1 Survival rate of BHK-21 cell treated with BPENote: Compared with cell control, ***P<0.001; **P<0.01.3.2 PrV 的 TCID50測(cè)定結(jié)果表 2-4 PrV 的 TCID50測(cè)定和計(jì)算（Reed-Muench 法）Table 2-4 TCID50determination and calculation of PrV (Reed-Muench method)毒稀釋度細(xì)胞病變 累計(jì)孔數(shù)細(xì)胞孔數(shù) 病出現(xiàn)細(xì)胞病變不出現(xiàn)細(xì)胞病變出現(xiàn)細(xì)胞病變不出現(xiàn)細(xì)胞病變10-18 0 49 0 49 (410-28 0 41 0 41 (410-38 0 33 0 33 (310-48 0 25 0 25 (2

鬼針草抗偽狂犬病毒的作用研究圖 2-2 結(jié)果表明，與病毒組相比，2.5，5，10 mg/ml 鬼針草提取物和 0.5 mg/mL伐昔洛韋處理 BHK-21 細(xì)胞后感染 PrV，細(xì)胞存活率與病毒組相比均差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明鬼針草提取物及伐昔洛韋提前給藥后感染病毒的給藥方式不能有效保護(hù) BHK-21 細(xì)胞免受 PrV 侵染造成活力下降或死亡。

圖 2-2 預(yù)防模式 BHK-21 細(xì)胞的存活率注：與細(xì)胞對(duì)照相比，***P<0.001；與病毒組相比，###P<0.001Figure 2-2 Survival rate of BHK-21 cell in the prevention modeNote: Compared with cell control, ***P<0.001; Compared with PrV, ###P<0.001.2 預(yù)防模式抗病毒檢測(cè)結(jié)果（CPE）圖 2-3 顯示病毒組和 2.5，5，10 mg/ml 鬼針草提取物及 0.5 mg/mL 伐昔的細(xì)胞病變無(wú)明顯差異，說(shuō)明先用鬼針草提取物和伐昔洛韋處理 B不能有效保護(hù)其感染 PrV 并產(chǎn)生病變。
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本文編號(hào)：2876506