牛病毒性腹瀉病(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的多臨床表現(xiàn)的疾病。各個年齡的牛對該病均易感,其臨床癥狀主要包括急性出血綜合癥、持續(xù)性感染、免疫抑制、免疫耐受、呼吸道和胃腸道疾病、生殖功能不全。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類傳染病,在我國入境動物傳染病名錄將其列為二類傳染病。BVD最早發(fā)現(xiàn)于美國紐約州,隨后分離到病毒,此后世界各地陸續(xù)報告了該病的發(fā)生。我國學(xué)者李佑民于1983年自牛的流產(chǎn)胎兒脾臟分離并鑒定了BVDV,系我國對該病的首次報道。BVD在世界范圍內(nèi)呈地區(qū)性流行,畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)的動物感染率較高,成為危害養(yǎng)牛業(yè)的主要傳染病之一,對世界的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。1.鹿源牛病毒性腹瀉病毒分離鑒定及遺傳變異分析對采自吉林省鹿的疑似腹瀉樣品進(jìn)行處理后接種牛腎細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)對病毒進(jìn)行分離,經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,確定為鹿源牛病毒性腹瀉病毒,分別命名為:BVDV JL01、BVDV F3、BVDV Y3、BVDV de4和BVDV SY4。采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞實驗對分離株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和TCID_(50)測定,結(jié)果表明:BVDV JL01、BVDV F3、BVDV Y3、BVDV de4、BVDV SY4的TCID_(50)分別為10~(5.3)TCID_(50)/mL、10~(5.8)TCID_(50)/mL、10~(4.7)TCID_(50)/mL、10~(5.5)TCID_(50)/mL和10~(4.4)TCID_(50)/mL。BVDV-JL01、BVDV-F3、BVDV-Y3、BVDV-de4為cpBVDV,BVDV-SY4為ncp BVDV。根據(jù)Genbank登錄的BVDV不同毒株的參考序列設(shè)計引物擴增Npro和E2基因,使用DNAStar對分離株BVDV Npro和E_2基因與Genbank中登錄的BVDV不同基因型進(jìn)行核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明:BVDV-JL01、BVDV-F3、BVDV-Y3、BVDV-de4為BVDV-1型,BVDV-SY4為BVDV-2型。對分離毒株E2蛋白的糖基化位點預(yù)測結(jié)果表明,BVDV-JL01株和BVDV-de4株均有9個潛在的N-糖基化位點,BVDV-Y3株和BVDV-SY4株均有10個潛在的N-糖基化位點,糖基化位點不一致。BVDV-F3株具有11個潛在的糖基化位點。2.牛病毒性腹瀉病毒激活NF-κB分子機制研究通過雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)分析cp和ncp不同生物型BVDV感染對MDBK細(xì)胞中NF-κB的激活作用,結(jié)果表明cp型BVDV可顯著激活與未感染組比較,cp型BVDV JL01株在感染48h可顯著激活NF-κB,而ncp型BVDV SY4株感染未能激活NF-κB,且cp型BVDV對NF-κB的激活存在量效關(guān)系。激光共聚焦分析結(jié)果表明,與未感染對照組比較,隨著感染時間的增加cp型BVDV感染顯著激活了NF-κB的表達(dá),在感染4h NF-κB p65表現(xiàn)為明顯的核轉(zhuǎn)位。ncp型BVDV感染未見p65核轉(zhuǎn)位。表明cp型BVDV感染激活NF-κB表達(dá),并引起核轉(zhuǎn)位。通過Real-time PCR和Western blot分析TL3、TLR4、RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑BVDV激活NF-κB的信號通路,為研究BVDV致病機制奠定基礎(chǔ)。3.激活NF-κB信號通路牛病毒性腹瀉病毒蛋白篩選為了鑒定BVDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在激活NF-κB中的作用,構(gòu)建BVDV各個基因的真核表達(dá)載體,將其與NF-κB報告質(zhì)粒和海腎內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后通過雙熒光報告系統(tǒng)進(jìn)行分析,結(jié)果表明BVDV NS5B蛋白能顯著激活NF-κB。4.牛病毒性腹瀉病毒NS5B激活NF-κB分子機制研究為了探究BVDV NS5B對NF-κB的激活機制。將NS5B蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,表明NS5B對NF-κB的激活存在量效關(guān)系,NS5B蛋白可誘導(dǎo)IκB降解,胞漿p65和胞核內(nèi)p65蛋白的磷酸化。為了進(jìn)一步明確NS5B蛋白激活NF-κB的功能域,基于NS5B蛋白結(jié)構(gòu)域,將NS5B截短為6段進(jìn)行分段表達(dá),NS5B-NT、NS5B-Core、NS5B-finger、NS5B-palm、NS5B-thumb和NS5B-CT。雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NF-κB和海腎熒光素酶活性,結(jié)果表明,BVDV NS5B蛋白、NS5B-Core、NS5B-finger和NS5B-palm均能激活NF-κB,空載體對照組相比差異極顯著,說明激活NF-κB的區(qū)域位于NSB5蛋白的RdRp聚合酶催化活性中心。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染NS5B截短突變體后IFN-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果表明,NS5B的截短突變體通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)IFN-ⅠmRNA水平的升高。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

牛病毒性腹瀉病毒基因組結(jié)構(gòu)圖

樣受體 樣受體組成和分布免疫是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線。宿主的天然免疫系統(tǒng)通pattern recognition receptors，PRRs）病原相關(guān)分子模式（pathogen patterns，PAMPs）。Toll 樣受體是可在近 20 多種細(xì)胞上表達(dá)的一類模 受體結(jié)構(gòu)為Ⅰ型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，由負(fù)責(zé)識別 PAMPs 的富含亮氨酸保守含 TIR 的胞內(nèi)區(qū)和富含亮氨酸，決定 TLRs 亞細(xì)胞定位的跨膜區(qū)組成。氨酸重復(fù)基序（leucine-rich repeat，LRR）決定了其在細(xì)胞中的定位。鼠有 12 種 TLRs，牛有 10 種 TLRs：TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6面表達(dá)，識別細(xì)菌細(xì)胞壁成分和病毒顆粒；TLR3、TLR7、TLR8、TLR9細(xì)胞內(nèi)的囊泡膜或細(xì)胞器膜上表達(dá)，識別細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的病毒核苷酸，參反應(yīng)。TLR2 與 TLR1 或 TLR6 識別革蘭氏陽性菌中的肽聚糖、脂蛋白-124]（圖 1.2）。

.2.1 RIG-ⅠRIG-Ⅰ是一個雙鏈 RNA 依賴的 ATPase。在未感染細(xì)胞中，RIG-Ⅰ呈自我反應(yīng)構(gòu)象，ARDs 難以參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CTD 介導(dǎo) RIG-Ⅰ解旋酶結(jié)構(gòu)域與 RNA 的 5′三磷酸末端結(jié)合。毒 RNA 與 RIG-Ⅰ結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象發(fā)生變化 CARD 暴露出來與 E3 連接酶 TRIM25 依賴的泛素化 K63 的 L172 或內(nèi)源性 K63 連接的聚泛素鏈結(jié)合[144-145]。多聚泛素化的 CARD 通 CARD 與 CARD 的互作招募適配器 MAVS[143,146]。激活后，MAVS 聚集在線粒體膜外，過系列適配器和激酶，激活轉(zhuǎn)錄因子 IRF3、IRF7、AP1 和 NF-κB 協(xié)同調(diào)控 IFN-I 基因表達(dá)[147]。若干額外的蛋白修飾酶和 RNA 結(jié)合增強子可調(diào)控。許多病毒形成了抵抗 RLH路的機制，包括新世界沙粒病毒 Z 蛋白對 RIG-I 的直接抑制作用，流感病毒 NS1 蛋白過 TRIM25 介導(dǎo) RIG-I 的聚泛素化，HCV 蛋白通過裂解 MAVS 而滅活[148-150]。.2.2 MDA5MDA5 介導(dǎo)抗病毒感染的先天免疫反應(yīng)。MDA5 可識別長度在 0.5~7kb 之間的細(xì)胞和圖 1.3 RLR 受體示意圖Fig.1.3 Schematic representation of RLR
【參考文獻(xiàn)】

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1 杜銳,杜威,王樹志;粘膜病病毒感染幼鹿的病原流行病學(xué)調(diào)查[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2000年03期

2 王新平，宣華，朱維正，常國權(quán)，李佑民，王克堅，王曉偉;鹿感染牛病毒性腹瀉－粘膜病病毒的調(diào)查[J];中國畜禽傳染病;1995年04期

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1 陳銳;中國西部四省區(qū)散養(yǎng)肉牛BVDV流行病學(xué)調(diào)查和一株分離毒株的全基因組測序[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2016年

本文編號：2876163