哺乳動物卵母細(xì)胞的體外成熟是核移植、轉(zhuǎn)基因動物等胚胎工程技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。雖然卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)研究已經(jīng)取得了長足進(jìn)展,但由于卵母細(xì)胞體內(nèi)外生長發(fā)育的生理環(huán)境不同,導(dǎo)致卵母細(xì)胞的體外成熟效率遠(yuǎn)低于體內(nèi)成熟。CK1是細(xì)胞有絲分裂和Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵激酶,影響細(xì)胞的增殖分化。本研究探討了 CK1的抑制劑D4476對牛卵母細(xì)胞體外成熟效率的影響及其作用機(jī)制,以便為完善牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)。首先,探討了 D4476對牛COCs的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、體外成熟及其隨后胚胎發(fā)育潛能的影響。黃牛COCs經(jīng)含不同濃度D4476(0、2、5、10、20μmol/L)的成熟培養(yǎng)液培養(yǎng) 24h后,2μmol/L 和 5μmol/L D4476處理組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展平均分值與對照組差異不顯著(2.57、2.67vs2.68,P0.05),而 10μmol/L、20μmol/LD4476 處理組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展平均分值顯著低于對照組(1.92、1.26 vs2.68,P0.05);5 μmol/L和10 μmol/LD4476處理組的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于對照組(70.15%、73.94%vs 53.65%,P0.05),2μmol/L 和 20μmol/L D4476處理組的卵母細(xì)胞成熟率與對照組差異不顯著(62.77%、67.85%vs 53.65%,P0.05)。各成熟培養(yǎng)處理組的卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后發(fā)現(xiàn),2 μmol/L和5 μmol/L D4476處理組的卵母細(xì)胞體外受精分裂率與對照組差異不顯著(70.90%、73.52%vs 69.43%,P0.05),10 μmol/L和20 μmol/L D4476處理組的分裂率顯著低于對照組(59.17%、48.57%vs69.43%,P0.05);2μmol/L、5μmol/L和 10μmol/LD4476處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于對照組(20.05%、28.00%、19.72%vs 15.67%,P0.05),20μmol/LD4476處理組的囊胚發(fā)育率與對照組差異不顯著(14.71%vs 15.67%,P0.05)。其次,探討了 D4476影響牛卵母細(xì)胞體外成熟效率的作用機(jī)制。實(shí)時熒光定量PCR和PI染色檢測分析發(fā)現(xiàn),5 μmol/LD4476處理組的卵母細(xì)胞CK1表達(dá)量顯著下降(P0.05),但對卵母細(xì)胞核形態(tài)沒有影響;Wnt信號相關(guān)基因β-catenin和Cx43表達(dá)無顯著變化(P0.05),TCF-4的表達(dá)顯著提高(P0.05)。5 μmol/LD4476處理組的卵丘細(xì)胞凋亡基因Bad表達(dá)無顯著變化(P0.05),Wnt信號相關(guān)基因β-catenin、Cx43和TCF-4,增殖基因CTSB和MAPK,擴(kuò)展基因PTGS-2、PTX-3和TGS-6,凋亡基因Bax以及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)顯著升高(P0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示,5μmol/LD4476處理組的卵丘細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)在體外成熟過程中下降,在成熟后升高。以上結(jié)果表明,成熟培養(yǎng)液中添加5 μmol/LD4476能夠提高黃牛卵母細(xì)胞體外成熟效率及其隨后的胚胎發(fā)育能力,這一作用可能是D4476抑制了參與卵母細(xì)胞自發(fā)減數(shù)分裂的CK1的表達(dá),提高核內(nèi)轉(zhuǎn)錄輔助因子TCF-4的表達(dá);同時,模擬Wnt信號,促進(jìn)卵丘細(xì)胞的增殖、擴(kuò)展,延緩卵丘細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

大學(xué)碩士學(xué)位論文?．ＣＫ１抑制劑對牛卵母細(xì)胞體夕卜成熟培養(yǎng)的夠使結(jié)腸腺瘤樣息肉病蛋白和軸蛋白特定位點(diǎn)磷酸化，然后ＧＳＫ－３Ｊ３、ＣＫＣ與Ａｘｉｎ蛋白不同區(qū)域結(jié)合形成Ａｘｉｎ／ＧＳＫ－３ｐ／ＣＫｌａ／ＡＰＣ復(fù)合體，然后的Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ與復(fù)合體結(jié)合。首先Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ被ＣＫ１識別并磷酸化Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎＳｅｒ４５［５５］，緊接著被ＧＳＫ－３Ｐ進(jìn)一步磷酸化［５６］，然后被Ｐ－Ｔｒｃｐ識別而發(fā)生泛進(jìn)入蛋白酶體降解，使細(xì)胞內(nèi)Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ維持在一個較低的水平，從而抑因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Ｗｎｔ蛋白和膜上Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白結(jié)合后，能夠使ＣＫ１的活性，無法隣酸化Ａｘｉｎ，從而使細(xì)胞內(nèi)Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ大量積累，隨后（３－ｃａｔｅｎｉｎ進(jìn)內(nèi)，進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［５７］。細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄只要是指當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ細(xì)胞核內(nèi)，ＴＣＦ和轉(zhuǎn)錄抑制因子Ｃｒｏｕｃｈｏ等結(jié)合在ＷＲＥ序列上，下游錄將被抑制；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ進(jìn)入細(xì)胞核，Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、ＴＣＦ和多種輔因子結(jié)合，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄??ａｗｍｏｆｆ?ＨＬＷ－．－６ｂ?Ｗｎ，ｏｎ??

圖４?Ｄ４４７６對黃牛卵母細(xì)胞核形態(tài)的影響??Ａ：?Ｏｊａｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６?Ｂ：?５｜ｉｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｄ４４７６?ｏｎ?ｎｕｃｌｅａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｉｎ?ｂｏｖｉｎｅ?ｏｏｃｙｔｅ??Ａ：?０｜ａｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６?Ｂ：?５｜ｉｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６??

圖５?Ｄ４４７６對黃牛卵母細(xì)胞內(nèi)ｙＳ－ｃ攸ｍｉ、ＴＣ／Ｗ、Ｃｘ？表達(dá)的影響??注：標(biāo)注不同字母代表差異顯著（Ｐ＜０．０５）??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2875136