在畜牧生產(chǎn)中,鉻常用作飼料添加劑,以改善畜禽胴體品質(zhì)、提高飼料利用率及增強(qiáng)抗應(yīng)激能力等,但其應(yīng)用不恰當(dāng),也會(huì)造成動(dòng)物機(jī)體的慢性中毒。許多研究表明,肝臟是鉻的主要靶器官之一,且過(guò)量的鉻可以誘導(dǎo)多種動(dòng)物模型發(fā)生細(xì)胞自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激�；ㄇ嗨厥翘烊坏狞S酮類化合物,具有抗氧化、清除自由基、抗癌和抗腫瘤等作用。因此,為充分了解鉻(Ⅵ)對(duì)LMH細(xì)胞的毒性作用及紫番茄花青素(PTA)對(duì)鉻(Ⅵ)誘導(dǎo)LMH細(xì)胞自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用,本試驗(yàn)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬兩個(gè)方面對(duì)PTA的保護(hù)作用進(jìn)行研究。試驗(yàn)中通過(guò)建立LMH細(xì)胞中毒模型,將紫番茄花青素與鉻(Ⅵ)單獨(dú)處理或共孵育處理20h。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察及檢測(cè)細(xì)胞存活率來(lái)驗(yàn)證鉻(Ⅵ)誘導(dǎo)LMH細(xì)胞損傷水平、自噬水平及花青素對(duì)其保護(hù)作用;通過(guò)添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑(Tg)及抑制劑(4-PBA)來(lái)驗(yàn)證本試驗(yàn)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的關(guān)聯(lián);通過(guò)Western Blot、ELISA檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(GRP78/Bip及PERK)、自噬相關(guān)蛋白(LC3、P62、Beclin1和mTOR)及COX-2蛋白水平變化,進(jìn)而驗(yàn)證鉻(Ⅵ)及花青素對(duì)LMH細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬水平的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,鉻(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞脫落并降低細(xì)胞大小及密度,降低細(xì)胞存活率,而PTA能減輕鉻(Ⅵ)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷。當(dāng)3-MA抑制自噬時(shí),能夠顯著改善鉻(Ⅵ)引起的細(xì)胞存活率降低現(xiàn)象,且PTA發(fā)揮著與3-MA相似的功效。當(dāng)添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑(Tg)或抑制劑(4-PBA)時(shí),能夠相應(yīng)的加重或減輕鉻所引起的細(xì)胞活性降低現(xiàn)象。鉻(Ⅵ)可顯著誘導(dǎo)自噬標(biāo)志性蛋白(Beclin1和LC3 II/I),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白(GRP78和PERK)和COX-2蛋白水平升高,抑制通路蛋白mTOR和自噬相關(guān)蛋白P62的表達(dá),而PTA可以緩解鉻(Ⅵ)誘導(dǎo)的上述蛋白表達(dá)量的變化�？傊�,試驗(yàn)表明Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)LMH細(xì)胞發(fā)生過(guò)度自噬,而紫番茄花青素(PTA)可改善Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,這為Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的重金屬中毒保護(hù)劑的篩選提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S816
【部分圖文】：

21圖 1 花青素對(duì) LMH 細(xì)胞中 Cr(VI)誘導(dǎo)的形態(tài)變化及細(xì)胞活性的影響(100μmol/L)和 Rapa(1μmol/L)分別作為自噬陰性和陽(yáng)性對(duì)照；Tg(10μmol/L)和 4-PBA(1mM)分性和陰性對(duì)照。(A) 不同 Cr(VI)濃度下的細(xì)胞存活率。(B)20μm Cr(VI)處理不同時(shí)間后的細(xì)胞活) 細(xì)胞活性。比例尺：600μm。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。沒(méi)有共同字母的表示具有顯著差Figure 1 Effect of PTAon Cr(VI)-induced morphology and cell viability in LMH cells. (100 μmol/L) and Rapa (1μmol/L) were set as autophagy negative and positive controls. Tg(10M) were set as autophagy negative and positive controls. (A)Cell viability under different Cr(VI) coitality under different time conditions of 20 μM Cr(VI). (C) Cell morphology. (D) Cell viability. Scale presented as mean±SD (n=3). Bars without a shared common letter were significantly different (P< 0.

花青素對(duì)鉻(VI)致 LMH 細(xì)胞自噬中的保護(hù)作用3.2 花青素通過(guò)抑制 PERK 和 GRP78 的蛋白水平抑制 Cr(VI)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激本課題組以前的研究表明，Cr(VI)可誘導(dǎo) DF-1 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本試驗(yàn)嘗試研究 Cr(VI)能否誘導(dǎo) LMH 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及紫番茄花青素(PTA)對(duì)其調(diào)節(jié)作用。GRP78/Bip 和 PERK 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩個(gè)重要指標(biāo)，因此檢測(cè)其蛋白水平變化。我們的研究結(jié)果(圖 2)表明 Cr(VI)誘導(dǎo) LMH 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Cr(VI)處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白 GRP78 / Bip 和 PERK 的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。同時(shí) PTA(100μg/mL)+Cr 處理組中 GRP78/Bip 和 PERK 蛋白水平顯著低于 Cr(VI)組；PTA(100μg/mL)+Cr 處理組GRP78/Bip 和 PERK 的表達(dá)顯著低于 PTA(50μg/mL)+Cr 處理組。這些結(jié)果表明 PTA 可以減輕由 Cr(VI)引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并且呈濃度劑量依賴。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文3.3 花青素通過(guò)改變 LC3 和 P62 蛋白的水平抑制 Cr(VI)誘導(dǎo)的自噬LC3 是酵母 Atg8 的自噬體直系同源物。已經(jīng)顯示脂質(zhì)形式的 LC3，LC3-II 是動(dòng)物機(jī)體中的自噬體標(biāo)記物。P62 參與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)的降解過(guò)程，并且是自噬的標(biāo)記蛋白。本試驗(yàn)中，在 Cr(VI)處理組中，LC3-II 的表達(dá)水平高于對(duì)照組(圖 3-A)，P62 的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(圖 3-B)。然而，通過(guò) PTA(100μg/mL)與 Cr(VI)共處理可以顯著減弱鉻處理引起的蛋白變化，表明 PTA 可通過(guò)改變 LC3 和 P62 的蛋白水平抑制 Cr(VI)誘導(dǎo)的自噬。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2874762