發(fā)布時間：2020-11-06 14:21

　　 雞的卵泡發(fā)育具有連續(xù)發(fā)育、有優(yōu)先等級排列且排卵后沒有黃體形成等特點。當卵泡發(fā)育遵循一個非常嚴格的優(yōu)先等級結構時,就能達到最佳的繁殖效率和產(chǎn)蛋性能。雞的卵泡選擇通常發(fā)生在6–8 mm直徑的小黃卵泡池中,大約每天會有一個卵泡被選擇成為等級卵泡。被選擇后卵泡的顆粒細胞開始分化,對促卵泡生成素(follicle stimulate hormone,FSH)的敏感性顯著增加,FSH的刺激使顆粒細胞開始分泌孕酮。在哺乳動物卵泡選擇的過程中,顆粒細胞對FSH的敏感性被認為受到抗繆勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)的抑制,進而抑制竇前卵泡發(fā)育。然而,AMH在雞的卵泡選擇中是否發(fā)揮著與在哺乳動物中相同的作用仍不清楚。本研究通過添加外源雞AMH和對AMHR2基因進行特異敲除的手段,改變體外培養(yǎng)的顆粒細胞接受AMH刺激的信號強度,從而研究AMHR2對雞卵泡選擇過程中顆粒細胞孕酮合成的影響,為AMHR2介導的AMH在雞卵泡選擇過程中的調控作用提供理論依據(jù)。研究結果如下:1.為了探究外源添加的AMH對雞卵泡顆粒細胞的影響,本研究在用不同濃度的AMH(0,5,10,20,40,80 ng/mL)處理分離培養(yǎng)自6–8 mm卵泡的顆粒細胞后,通過ELISA和qPCR分別檢測培養(yǎng)基中孕酮含量及顆粒細胞中孕酮合成相關基因的表達量。結果表明,20 ng/mL的AMH處理能夠增強顆粒細胞中孕酮合成相關基因的表達,AMH在調節(jié)卵泡FSH閾值中起關鍵作用,當AMH處于一個相對敏感的適宜濃度時能夠降低FSH閾值,增強FSH對6–8 mm卵泡的刺激,從而影響優(yōu)勢卵泡選擇和孕酮合成。2.成功構建了特異打靶雞AMHR2基因的敲除表達系統(tǒng),包括一對分別打靶雞AMHR2基因同一外顯子上距離小于30 bp的兩個靶位點的敲除表達載體pX330-U6-AMHR2_dBsa I-CBh-hSpCas9和相應的SSA-RPG雙熒光報告載體pB-CMV-DsRed-CAG-AMHR2.200bp repeat.Puro-T_2A-GFP。通過轉染HEK293T細胞和DF-1細胞檢測敲除系統(tǒng)的工作效率,經(jīng)過Puromycin藥物篩選富集陽性DF-1細胞后,在雞的基因組上成功敲除了AMHR2基因(~60%)。3.利用雞AMHR2基因敲除表達載體及相應的雙熒光報告載體,共轉染分離培養(yǎng)自6–8 mm卵泡的顆粒細胞,通過qPCR檢測篩選富集后的顆粒細胞中孕酮合成相關基因的表達量,結果表明AMHR2基因與孕酮合成相關基因存在正相關關系。綜上所述,在雞的卵泡顆粒細胞中,AMHR2基因與孕酮合成相關基因存在著正相關關系,其參與調控顆粒細胞孕酮合成的具體分子機制仍需要進一步試驗驗證。本研究通過分析AMHR2對雞卵泡選擇過程中顆粒細胞孕酮合成的影響,為雞卵泡選擇的調控因子和調控機制提供了理論依據(jù),有助于了解雞卵泡發(fā)育和卵泡選擇過程中的分子機理。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S831
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 雞的卵泡發(fā)育
        1.1.1 雞的卵巢結構與卵泡發(fā)育
        1.1.2 雞的卵泡選擇
        1.1.3 雞卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞的作用
    1.2 AMH與 AMHR2 的研究進展概述
        1.2.1 AMH在卵泡發(fā)育過程中的作用
        1.2.2 AMHR2在AMH信號轉導中的作用
    1.3 雞卵巢中的孕酮合成
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 AMH處理對體外培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細胞的影響
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 試驗試劑及試劑配制
        2.1.3 試驗儀器
        2.1.4 引物
    2.2 試驗方法
        2.2.1 不同發(fā)育階段卵泡中孕酮合成相關基因表達的檢測
        2.2.2 雞原代顆粒細胞的分離
        2.2.3 雞原代顆粒細胞的培養(yǎng)
        2.2.4 雞原代顆粒細胞的傳代
        2.2.5 AMH處理體外培養(yǎng)的顆粒細胞
        2.2.6 AMH處理后顆粒細胞培養(yǎng)基中孕酮濃度檢測
        2.2.7 檢測AMH處理后顆粒細胞中孕酮合成相關基因的表達
    2.3 試驗結果
        2.3.1 不同發(fā)育階段卵泡孕酮合成基因的轉錄表達量
        2.3.2 顆粒細胞培養(yǎng)基中孕酮含量的檢測
        2.3.3 顆粒細胞中孕酮合成相關基因的轉錄表達量
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 雞AMHR2 基因敲除相關載體的構建與驗證
    3.1 試驗材料
        3.1.1 菌株、載體與細胞系
        3.1.2 試驗試劑及試劑配制
        3.1.3 試驗儀器
        3.1.4 引物
    3.2 試驗方法
        3.2.1 雞AMHR2 基因靶位點的選擇
        3.2.2 雞AMHR2 基因敲除載體的構建
        3.2.3 SSA-RPG雙熒光報告載體的構建
        3.2.4 HEK293T細胞的培養(yǎng)與轉染
        3.2.5 DF-1 細胞的培養(yǎng)與轉染
        3.2.6 Puromycin藥物篩選DF-1 細胞
        3.2.7 T7E1 核酸內切酶檢測
        3.2.8 TA克隆檢測
    3.3 試驗結果
        3.3.1 構建雞AMHR2 基因的敲除表達載體
        3.3.2 SSA-RPG雙熒光報告載體的構建
        3.3.3 報告載體水平檢測兩組敲除表達載體的工作效率
        3.3.4 基因組水平檢測兩組敲除表達載體的工作效率
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 敲除AMHR2 基因對雞卵泡顆粒細胞的影響
    4.1 試驗材料
        4.1.1 載體與試驗動物
        4.1.2 試驗試劑及試劑配制
        4.1.3 試驗儀器
        4.1.4 引物
    4.2 試驗方法
        4.2.1 敲除雞卵泡顆粒細胞中AMHR2 基因
        4.2.2 Puromycin藥物篩選富集陽性顆粒細胞
        4.2.3 敲除AMHR2 基因對顆粒細胞孕酮合成相關基因表達的影響
    4.3 試驗結果
        4.3.1 顆粒細胞中報告載體水平上AMHR2 的敲除效率
        4.3.2 Puromycin藥物篩選富集陽性顆粒細胞
        4.3.3 敲除AMHR2 后顆粒細胞中孕酮合成相關基因的表達變化
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 結論
附錄
參考文獻
致謝
個人簡歷

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周瑾,陳士嶺,邢福祺,朱偉杰;角質細胞生長因子及其受體在人卵泡膜細胞和顆粒細胞的分布[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2003年01期

2 趙玉蓮;生長因子影響顆粒細胞分化[J];國外醫(yī)學.內分泌學分冊;1988年04期

3 盧延齡,許河生;前列腺素E_2、F_(2α)對大鼠顆粒細胞PA活力的影響[J];實驗生物學報;1988年03期

4 林金芳,鄭懷美;醋酸棉酚對大鼠成熟卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生雌二醇及孕酮功能影響的離體觀察[J];生殖與避孕;1988年04期

5 濮季行;;白細胞介素-1抑制豬離體培養(yǎng)顆粒細胞的黃體化[J];生理科學進展;1988年03期

6 濮季行;;生長激素和胰島素樣生長因子-Ⅰ加速孕馬血清促性腺激素誘發(fā)的顆粒細胞分化[J];生理科學進展;1988年04期

7 李慧珍;趙涉云;游美梅;莊臨之;王紅;李榮皓;羅淑宜;;己烯雌酚對未成熟大鼠卵巢卵泡顆粒細胞分化的形態(tài)學觀察[J];解剖學報;1988年02期

8 王淑君;龐月岱;;氯氮平致顆粒細胞缺乏死亡1例報告[J];山東精神醫(yī)學;1988年01期

9 劉以訓,胡召元,林曉,鄒如金;幼猴和成年猴顆粒細胞離體下甾體形成的激素調節(jié)[J];中國科學(B輯 化學 生命科學 地學);1989年12期

10 劉以訓;顆粒細胞分泌一種刺激卵母細胞組織型纖蛋白溶酶原激活因子的物質[J];中國科學(B輯 化學 生命科學 地學);1989年10期

相關博士學位論文 前10條

1 孟凱;WT1基因調控牛卵泡顆粒細胞和膜細胞類固醇激素生成的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

2 趙璠;Luman在小鼠顆粒細胞和子宮內膜基質細胞功能調節(jié)中的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2018年

3 陳洋;牛卵泡發(fā)育相關基因篩選及SIRT1、INHBA基因功能研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2018年

4 張馨月;BMP6對排卵前后人卵泡顆粒細胞中相關基因表達的調控[D];吉林大學;2018年

5 陳樹雄;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對牛卵泡顆粒細胞增殖和類固醇激素分泌的影響[D];吉林大學;2018年

6 余雛琳;miR-375介導CRH對豬卵巢顆粒細胞E2合成的負調控[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2018年

7 呂躍;單細胞轉錄組技術及在原始卵泡激活機制研究中的應用[D];山東大學;2018年

8 隋明醒;人羊水干細胞預防和逆轉順鉑所致卵巢損傷的實驗研究[D];吉林大學;2017年

9 張世紅;胰島素和胰島素樣生長因子系統(tǒng)及血管內皮生長因子在PCOS發(fā)病機制中的作用[D];吉林大學;2006年

10 賈怡昌;TRPC通道促進小腦顆粒細胞存活并參與BDNF介導的神經(jīng)元軸突導向[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2006年

相關碩士學位論文 前10條

1 王洋洋;FSH對牛體外有腔卵泡膜細胞和顆粒細胞類固醇激素合成相關基因表達的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2019年

2 何艷桃;MEX3C調控IGF-1R促進小鼠顆粒細胞體外增殖的機制研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2019年

3 紀藝珍;TGF-β1對人顆粒細胞細胞外基質相關基因表達及相關信號通路的調控作用研究[D];上海交通大學;2017年

4 黃思嘉;AMHR2對雞卵泡選擇過程中顆粒細胞孕酮合成的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

5 孔月;Lnc-GULP1-2:1/COL3A1參與調控顆粒細胞增殖與凋亡的機制研究[D];鄭州大學;2019年

6 王斯嘉;GDF-8在人顆粒細胞調控芳香化酶表達及參與PCOS發(fā)生的分子機制的研究[D];鄭州大學;2019年

7 吳艷艷;Fstl1在小鼠卵巢泡發(fā)育中的作用研究[D];蘇州大學;2017年

8 何六濤;骨形成發(fā)生蛋白6（BMP6）在雞卵泡中的表達及功能初步研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2017年

9 張學友;Chemerin和GPR1基因的克隆與組織表達及Chemerin在顆粒細胞中的作用初探[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2017年

10 王賓帥;FoxO1調控鵝顆粒細胞脂肪酸代謝相關基因表達研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2017年

本文編號：2873255