【摘要】：犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種在食肉目動(dòng)物中廣泛傳播的急性,高傳染性疾病,具有較高的發(fā)病率和死亡率。CDV野毒株很難在無(wú)受體的細(xì)胞系上進(jìn)行傳代,嚴(yán)重制約CDV的深入研究。本研究旨在構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系,比較其對(duì)CDV野毒株的敏感性,并對(duì)分離到的CDV野毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究從以下幾個(gè)方面開展:Ⅰ SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系建立本將真核表達(dá)載體Pcag-SLAM分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞。經(jīng)G418壓力篩選結(jié)合有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆株,并通過(guò)RT-PCR、間接免疫熒光鑒定(IFA)和western blot等方法對(duì)穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系加以驗(yàn)證。結(jié)果顯示本試驗(yàn)成功構(gòu)建出SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系。Ⅱ CDV的分離及鑒定本研究探索了SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系對(duì)CDV的分離率,比較不同組織對(duì)同種細(xì)胞系的趨向性,對(duì)分離得到的CDV進(jìn)行RT-PCR、IFA鑒定、電鏡觀察、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示利用SLAM-Vero細(xì)胞從3只CDV陽(yáng)性犬的肺和脾中分離得到2株CDV,而SLAM-BHK21細(xì)胞系,親本Vero細(xì)胞及親本BHK21細(xì)胞未能分離出病毒。Ⅲ CDV全基因組序列測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析對(duì)分離得到的CDV-SC1706株進(jìn)行全基因組測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)生分析,結(jié)果表明其核苷酸全長(zhǎng)15690 bp。SC1706分離株的N基因系統(tǒng)分析顯示該毒株與分離自遼寧的LN(10)1的同源性最高,達(dá)到99.6%,都屬于亞洲1型野毒株。SC1706株與大熊貓分離株SX2014和Louguantai 1的同源性也分別達(dá)到了98.4%和98.3%,顯示它們之間有很近的親緣關(guān)系。與經(jīng)典的onderstepoort疫苗株和shuskiy疫苗株的同源性很低,分別是有93.5%和93.1%。與CDV 3疫苗株的同源性最低,只有93%。SC1706株有9個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),這一特點(diǎn)是野毒株特有的。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

a：具有脂質(zhì)蛋白囊膜（黑色圓圈）的 CDV 示意圖b：CDV 基因組結(jié)構(gòu)模式圖。圖 1.1 在脂蛋白下面是病毒基質(zhì)蛋白(深粉紅色)，插入病毒囊膜的分別是血凝素蛋白(H)(黃色)和融合蛋白(F)(綠色)；大蛋白（L）（紫色）、核衣殼蛋白（N）（藍(lán)色）和磷蛋白（P）（深紫色）這三個(gè)蛋白一起形成核糖核酸蛋白復(fù)合物（RNP）。該示意圖沒有說(shuō)明蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度和比例。參考自 Sato 等人[26]。Fig. 1.1 Schematic diagram of a (a) CDV with a lipoprotein envelope (black circle), containing anon-segmented negative-sense ssRNAgenome, consisting of six genes (b). Adapted from Sato etal[26].

這兩種受體都存在一種類似免疫蛋白的一個(gè)結(jié)合面[78]。SLAM 作為免疫細(xì)胞受體[79]樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面[78, 80]。第二種細(xì)胞受 CDV 的上皮細(xì)胞受體[77, 82]，Nectin-4 參與細(xì)和內(nèi)皮組織的連接[83]。Nectin-4 被認(rèn)為是一種細(xì)胞釋放后，在感染的后期發(fā)揮作用[82]。M（CD150）激活分子(Signaling lymphocyte activation mol胞膜上的有八個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)的一種糖蛋麻疹病毒屬病毒的主要受體[85]，影響 CDV 的性[86]。SLAM 是有選擇的表達(dá)在免疫細(xì)胞，形病毒共同的受體[88]（結(jié)構(gòu)如圖 1.2）。

的殘基之間相似性很高，表明了這組動(dòng)，將貓科和犬科動(dòng)物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了幾科動(dòng)物 SLAM 受體的電荷差異[94]。因此不太適應(yīng)與另一個(gè)非犬的 SLAM 受體結(jié) 受體犬身上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的上皮細(xì)胞受體 ne的 6-9 d，病毒通過(guò)上皮細(xì)胞受體 Nect內(nèi)分泌系統(tǒng)的上皮細(xì)胞[82, 97]。當(dāng)宿主免統(tǒng)，使宿主產(chǎn)生神經(jīng)癥狀[98]。Nectin-4 ，其他未知的受體也可能參與其中[99]。異體，這兩種變體對(duì)病毒侵入及病毒在細(xì)
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本文編號(hào)：2870927