處于圍產(chǎn)期的奶牛由于能量需求的上升和干物質(zhì)采食量的減少,造成奶牛能量負平衡狀態(tài)(energy negative balance,NEB)。此時,脂肪細胞內(nèi)脂肪動員迅速加劇并進一步發(fā)展為脂代謝紊亂,造成高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFAs)血癥,它是圍產(chǎn)期奶牛主要的臨床病理學(xué)特征。而過量NEFAs的釋放會導(dǎo)致奶牛各種生產(chǎn)疾病,如奶牛酮病、脂肪肝、氧化應(yīng)激等,同時,高NEFAs的脂毒性也會嚴(yán)重損害奶牛生產(chǎn)健康。棕色脂肪細胞在動員脂肪,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中具有重要作用,因此,探究奶牛棕色脂肪細胞中脂質(zhì)代謝與奶牛高NEFAs血癥的關(guān)系顯得十分必要。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的小RNA分子(約22個核苷酸),其最主要的作用是通過與靶基因mRNA 3’端的非編碼區(qū)相結(jié)合,從而抑制靶基因的表達以調(diào)控細胞各項生理功能。MiRNA的作用十分廣泛,研究發(fā)現(xiàn),miRNA調(diào)節(jié)著哺乳動物大約30%-40%的基因。但是,奶牛棕色脂肪細胞在高NEFAs的miRNA調(diào)控機制卻罕有報道。因此,本論文的研究目的旨在研究高NEFAs狀態(tài)下,miRNA對奶牛棕色脂肪細胞的調(diào)節(jié)作用,為奶牛高NEFAs血癥的防治提供新思路和策略。本研究首先向體外培養(yǎng)的原代棕色脂肪細胞(選用11天完全分化成熟的細胞)培養(yǎng)液中添加NEFAs(0 mmol/L,0.3 mmol/L,0.6 mmol/L,1.2 mmol/L,2.4mmol/L),模擬奶牛高NEFAs血癥時的脂肪細胞狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)NEFAs濃度高于1.2 mmol/L時細胞內(nèi)甘油三脂(Triacylglycerol,TG)的含量顯著減少,培養(yǎng)液中甘油含量顯著上升。為探究其內(nèi)在調(diào)節(jié)機制,應(yīng)用此模型,采用二代測序技術(shù)檢測高NEFAs作用下(1.2 mmol/L)棕色脂肪細胞內(nèi)miRNA表達譜的變化。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,bta-miR-novel3表達顯著升高,甘油-3-磷酸酰轉(zhuǎn)移酶1(glycerol-3-phosphate acyltransferases-1,GPAT1)表達顯著降低。實時熒光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting,Western Blot)試驗也進一步驗證了上述結(jié)果。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明,bta-miR-novel3和GPAT1之間的靶向關(guān)系。進一步研究發(fā)現(xiàn),通過轉(zhuǎn)染bta-miR-novel3模擬體(mimics),將bta-miR-novel3在奶牛棕色脂肪細胞內(nèi)過表達,結(jié)果顯示mimics組脂肪細胞內(nèi)GPAT1表達量和胞內(nèi)TG含量顯著下降,培養(yǎng)液中甘油含量顯著上升;轉(zhuǎn)染bta-miR-novel3抑制劑(inhibitor)抑制bta-miR-novel3的表達時,結(jié)果顯示inhibitor組脂肪細胞內(nèi)GPAT1表達量和胞內(nèi)TG含量顯著增加,培養(yǎng)液中甘油含量顯著下降。另外,用高濃度NEFAs(1.2 mmol/L)處理脂肪細胞,同時轉(zhuǎn)染bta-miR-novel3 inhibitor抑制bta-miR-novel3的表達,結(jié)果顯示相較NEFAs組,bta-miR-novel3 inhibitor組GPAT1的表達量和胞內(nèi)TG含量得到回升,脂滴(Lipid droplets,LDs)變大,培養(yǎng)液中甘油含量下降。上述結(jié)果表明,通過抑制bta-miR-novel3的表達可以改善高濃度NEFAs(1.2 mmol/L)對棕色脂肪細胞脂肪蓄積能力的損害。綜上所述,高濃度NEFAs會引起奶牛體外培養(yǎng)原代棕色脂肪細胞bta-miRnovel3的表達上調(diào),而bta-miR-novel3則會通過抑制靶基因GPAT1的表達來抑制TG合成,從而加重NEFAs的產(chǎn)生,可能會進一步加重高NEFAs血癥。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

smallRNA文庫構(gòu)建流程圖

miRNA的合成與作用機制Fig.2SynthesisandMechanismofmiRNA

細胞生長第 9 天，分化第 4 天，脂肪細胞內(nèi)小 LDs 明顯增多，小 LDs 并開始匯集成較大的 LDs。圖1-1F，細胞生長第 11 天，分化第 6 天，視野下脂肪細胞內(nèi)有大量大粒的 LDs 出現(xiàn)，此時脂肪細胞已經(jīng)分化成熟。圖 1-1 棕色脂肪細胞的生長狀況A. 脂肪細胞生長第 1 天。B. 脂肪細胞生長第 3 天。C. 脂肪細胞生長第 5 天。D. 細胞生長第 7 天。E. 細胞生長第 9 天。F. 細胞生長第 11 天。Fig.1-1 The growth of brown adipocytesA. Day 1 of adipocytes growth. B. Day 3 of adipocytes growth. C. Day 5 ofadipocytes growth. D. Day 7 of adipocytes growth. E. Day 9 of adipocyte
【參考文獻】

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1 郭云濤;張秀秀;苗向陽;;牛miR-320a的靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2015年11期

本文編號：2870671