副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)作為一種豬呼吸道的條件致病菌,能引起豬的肺炎、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎以及胸腔積液、心包積液、腹腔積液和關(guān)節(jié)積液,嚴(yán)重阻礙豬的生長(zhǎng)育肥,并可致死亡,是保育豬威脅最大的病原菌之一。本研究從四川省部分地區(qū)的豬場(chǎng)采集疑似Hps感染病料進(jìn)行Hps的分離、鑒定與分型,同時(shí)表達(dá)、純化了Hps的YfeA蛋白,構(gòu)建用于檢測(cè)Hps抗體的間接ELISA方法。1.四川省部分地區(qū)Hps血清型調(diào)查2014年至2016年間,在四川省部分地區(qū)的規(guī)模化豬場(chǎng)及養(yǎng)豬合作社共采集649份病料,分離到288株Hps野毒,總分離率為44.38%,各年度分離率無顯著差異。四川東部和西部地區(qū)發(fā)病情況基本一致,3~8周齡的豬分離率顯著高于哺乳仔豬和8周齡以上的豬,冬、春季節(jié)分離率顯著高于夏、秋季節(jié)。結(jié)合多重PCR和瓊擴(kuò)試驗(yàn),對(duì)四川省部分地區(qū)Hps的血清型分布做了研究,結(jié)果表明,7.29%的分離株無法分型。2014年~2016年,四川省部分地區(qū)以血清4型、5型最為流行,其次為血清7型,未能分離到血清3型、6型、10型和15型的菌株。2.Hps抗體檢測(cè)間接ELISA構(gòu)建通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-yfeA,經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)、超聲破碎、純化,得到大小為36 kDa、濃度為0.698 mg/mL的Hps YfeA蛋白。經(jīng)方陣滴定實(shí)驗(yàn),最終確定YfeA蛋白最佳包被濃度為0.25μg/孔,HRP-兔抗豬IgG最佳稀釋度為1:4000,待檢血清的最佳稀釋度為1:40,封閉、稀釋和顯色條件也做了相應(yīng)優(yōu)化。經(jīng)計(jì)算,試驗(yàn)的判定前提為:陽性對(duì)照-陰性對(duì)照0.6,判定標(biāo)準(zhǔn)為:(樣品OD450nm-空白對(duì)照)/(陽性對(duì)照-空白對(duì)照)≥0.4,判為陽性,反之判為陰性。經(jīng)比較,該方法優(yōu)于全菌抗原間接ELISA,并具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性,與進(jìn)口商品化試劑盒的陽性和陰性符合率分別為79.2%和75%。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

圖 1 Hps 感染豬大體病變(A): 纖維素性心包炎; (B): 纖維素性肺炎Fig. 1 Gross lesions in Hps infected pigs(A): Fibrinous pericarditis (B): Fibrinous pleuritis分離株 mPCR & AGD 血清分型情況R（圖 2）與 AGD（圖 3）結(jié)合試驗(yàn)，267 株 Hps 分離株的血 Hps 無法分型，占總分離株的 7.29%。

圖 1 Hps 感染豬大體病變(A): 纖維素性心包炎; (B): 纖維素性肺炎Fig. 1 Gross lesions in Hps infected pigs(A): Fibrinous pericarditis (B): Fibrinous pleuritis.2 Hps 分離株 mPCR & AGD 血清分型情況經(jīng) mPCR（圖 2）與 AGD（圖 3）結(jié)合試驗(yàn)，267 株 Hps 分離株的血清型得到認(rèn)。21 株 Hps 無法分型，占總分離株的 7.29%。

著同源性極高的片段，因此多重 PCR 時(shí)血清 2 型和 11 型的菌株會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)條帶。Fig. 2 mPCR of serotyping for Hps field isolates and standard strains(A)M: DL 2000 DNA Marker (Takara); C: blank control; S1, S2, S4, S5, S7, S8 and S9: referencestrains of serovars 1, 2, 4, 5, 7, 8 and 98; FS1, FS2, FS4, FS5, FS7, FS8 and FS9: field isolates AB14011,GA14051, YA14041, GA14032, LS14031, GA15013, NC14041 (There were no field isolates ofserovars 3, 6, 10 or 15 obtained in the investigation).(B)M: DL 2000 DNA Marker (Takara); S11, S12, S13, S14, S3, S6, S10 and S15: reference strains ofserovars 11, 12, 13, 14, 3, 6, 10 and 15; FS11, FS12, FS13 and FS14: field isolates CD14021, LS15044,NJ14021, MY14021; N1: non-typeable strain; N2: APP; N3: Ss.Note: According to Howell et al, funB (target gene for serovar 1) was also identified in serovars 2 and11. Thus, except for their specific bands, the serovar -1-band can be also detected in serovars 2 and 11 inmPCR.
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本文編號(hào)：2869205