豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一種急性接觸性腸道傳染病,以引起哺乳仔豬腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征,一周齡內哺乳仔豬感染該病后死亡率可達100%,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前尚未有有效的疫苗和藥物。PED病原為豬流行性腹瀉病毒(Porcie Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)。PEDV的N基因編碼的N蛋白是一種多功能的病毒蛋白,但缺乏與其相互作用蛋白的研究報道。為進一步了解N蛋白的生物學功能,探究N蛋白在PEDV復制過程中發(fā)揮的作用,本研究對N蛋白的相互作用蛋白質組學進行研究,獲得與N蛋白相互作用的細胞蛋白,為下一步篩選抑制PEDV感染的藥物靶標提供理論依據(jù)。為獲得N蛋白相互作用的細胞蛋白,首先以PEDV PEDV LJX01/2014毒株的cDNA為模板,擴增PEDV N目的片段,將目的片段與pEGFP-C1真核表達載體進行連接,成功構建pEGFP-N重組質粒。將重組質粒轉染293T細胞后,利用Pull-down實驗特異性沉淀pEGFP-N蛋白及其相互作用的細胞蛋白并進行質譜分析,質譜結果表明,125種細胞蛋白可能與N蛋白相互作用。為了對質譜分析結果進行驗證,根據(jù)不同的與對照相比獲得的不同的變化比值篩選4種細胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1,用Western blot、免疫共沉淀和共定位研究進行鑒定。Western blot結果表明在293T和Vero E6細胞中,用N蛋白作為誘餌進行pull-down實驗,結果表明N蛋白與細胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1均有相互作用;同時在293T和Vero E6細胞中分別用抗DHX9、NCL、KAP1和TCEA1抗體進行免疫共沉淀,結果表明4種細胞蛋白均能與N相互作用。用共聚焦顯微鏡觀察這4種細胞蛋白與N蛋白的共定位現(xiàn)象,結果表明在感染PEDV的Vero E6和pEGFP-N轉染的293T細胞種,均發(fā)現(xiàn)NCL與pEGFP-N存在共定位,而與其他3各蛋白沒有共定位。本研究成功獲得PEDV N蛋白的相互作用蛋白質組學,為進一步研究PEDV的致病機制奠定基礎。
【學位單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1 PEDV 基因組和病毒結構圖（汪世雄等，2012）Fig. 1 Structural Diagram of PEDV genome（Wang et al., 2012）性腹瀉病毒病毒學分類地位尼多目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀nae ） 、 α- 冠 狀 病 毒 屬 （ Alphacoronavirus ） 成 員 。 α- 冠 狀avirus）成員包括人冠狀病毒 229E(Human coronavirus 229E)、豬orcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、長翼蝙蝠冠狀bat coronavirus 1) 、小黃蝠冠狀病毒 512(Scotophilus bat coronavir性腹瀉病毒非結構蛋白 蛋白的功能因編碼一個 25.3k Da 的 ORF3 非結構蛋白，是 PEDV 的一個輔助非結構蛋白對 PEDV 的致病性改變有輔助作用，對 PEDV 在宿主有具體影響，該蛋白可能與冠狀病毒毒力有關（Wongthida et al

圖 2 綠色熒光真核表達載體 pEGFP-C1 物體圖譜Fig. 2 The physical map of pEGFP-C1（http://www.biofeng.com/zaiti/buru/pegfp-n1.htmL）養(yǎng)基購自于 Gibco 公司；RIPA 細胞裂解液購自于碧；Protein marker 均購于Thermo 公司；0.25％胰蛋白酶購自于 GemCell 公司；羅氏脂質體(X-temeGENE HP trans素（Kan）同氨芐青霉素（Amp）購自于碧云天(BeyotimeFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購自 Thermo 公司；胰A 試劑盒、無內毒素質粒小提試劑盒購自康為公司；存管均購自上�？祵幑�；HRP-DAB 底物顯色試劑盒 BamH I 和 Xho I、Trans2K Plus DNAmarker 均購自 Ta、重鉻酸鉀、無水乙醇、冰乙酸、氯化鈉等均為國產分

圖 3 PCR 擴增 PEDV N 基因片段及 pEGEP-N 重組質粒鑒定圖R amplification of PEDV N gene fragment and pEGEP-N recombinant plasmid identificA：M：DNAMarker； 1：PEDV N 基因片段；Marker；1：陰性對照；2：pEGEP-N 菌液 PCR 鑒定結果；3：pEGEP-N 菌液 PCRC：M：DNAMarker；1：pEGEP-N 質粒酶切結果；2：pEGEP-N 質粒酶切結果；A: M: DNAMarker; 1. PEDV N gene fragment;Marker; 1: negative control; 2: pEGEP-N bacterial solution PCR identification results; 3bacterial solution PCR identification results;: DNAMarker; 1: pEGEP-N plasmid digestion results; 2: pEGEP-N plasmid digestion re的分析STAR 軟件分析測序結果，測序獲得的 PEDV N 基因片段與 GDNA 序列的相似性為 100%，蛋白序列的相似性為 100%。EGFP-N 質粒轉染 293T 細胞后的鑒定微鏡檢測 pEGEP-N 蛋白的表達 重組質粒在過生工測序后 DNASTAR 軟件分析證明該重組質粒
【參考文獻】

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本文編號：2869154