豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一種急性接觸性腸道傳染病,以引起哺乳仔豬腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征,一周齡內(nèi)哺乳仔豬感染該病后死亡率可達(dá)100%,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚未有有效的疫苗和藥物。PED病原為豬流行性腹瀉病毒(Porcie Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)。PEDV的N基因編碼的N蛋白是一種多功能的病毒蛋白,但缺乏與其相互作用蛋白的研究報(bào)道。為進(jìn)一步了解N蛋白的生物學(xué)功能,探究N蛋白在PEDV復(fù)制過程中發(fā)揮的作用,本研究對(duì)N蛋白的相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究,獲得與N蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白,為下一步篩選抑制PEDV感染的藥物靶標(biāo)提供理論依據(jù)。為獲得N蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白,首先以PEDV PEDV LJX01/2014毒株的cDNA為模板,擴(kuò)增PEDV N目的片段,將目的片段與pEGFP-C1真核表達(dá)載體進(jìn)行連接,成功構(gòu)建pEGFP-N重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,利用Pull-down實(shí)驗(yàn)特異性沉淀pEGFP-N蛋白及其相互作用的細(xì)胞蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜分析,質(zhì)譜結(jié)果表明,125種細(xì)胞蛋白可能與N蛋白相互作用。為了對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,根據(jù)不同的與對(duì)照相比獲得的不同的變化比值篩選4種細(xì)胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1,用Western blot、免疫共沉淀和共定位研究進(jìn)行鑒定。Western blot結(jié)果表明在293T和Vero E6細(xì)胞中,用N蛋白作為誘餌進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明N蛋白與細(xì)胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1均有相互作用;同時(shí)在293T和Vero E6細(xì)胞中分別用抗DHX9、NCL、KAP1和TCEA1抗體進(jìn)行免疫共沉淀,結(jié)果表明4種細(xì)胞蛋白均能與N相互作用。用共聚焦顯微鏡觀察這4種細(xì)胞蛋白與N蛋白的共定位現(xiàn)象,結(jié)果表明在感染PEDV的Vero E6和pEGFP-N轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞種,均發(fā)現(xiàn)NCL與pEGFP-N存在共定位,而與其他3各蛋白沒有共定位。本研究成功獲得PEDV N蛋白的相互作用蛋白質(zhì)組學(xué),為進(jìn)一步研究PEDV的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1 PEDV 基因組和病毒結(jié)構(gòu)圖（汪世雄等，2012）Fig. 1 Structural Diagram of PEDV genome（Wang et al., 2012）性腹瀉病毒病毒學(xué)分類地位尼多目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀nae ） 、 α- 冠 狀 病 毒 屬 （ Alphacoronavirus ） 成 員 。 α- 冠 狀avirus）成員包括人冠狀病毒 229E(Human coronavirus 229E)、豬orcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、長翼蝙蝠冠狀bat coronavirus 1) 、小黃蝠冠狀病毒 512(Scotophilus bat coronavir性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 蛋白的功能因編碼一個(gè) 25.3k Da 的 ORF3 非結(jié)構(gòu)蛋白，是 PEDV 的一個(gè)輔助非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì) PEDV 的致病性改變有輔助作用，對(duì) PEDV 在宿主有具體影響，該蛋白可能與冠狀病毒毒力有關(guān)（Wongthida et al

圖 2 綠色熒光真核表達(dá)載體 pEGFP-C1 物體圖譜Fig. 2 The physical map of pEGFP-C1（http://www.biofeng.com/zaiti/buru/pegfp-n1.htmL）養(yǎng)基購自于 Gibco 公司；RIPA 細(xì)胞裂解液購自于碧；Protein marker 均購于Thermo 公司；0.25％胰蛋白酶購自于 GemCell 公司；羅氏脂質(zhì)體(X-temeGENE HP trans素（Kan）同氨芐青霉素（Amp）購自于碧云天(BeyotimeFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購自 Thermo 公司；胰A 試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自康為公司；存管均購自上�？祵幑荆籋RP-DAB 底物顯色試劑盒 BamH I 和 Xho I、Trans2K Plus DNAmarker 均購自 Ta、重鉻酸鉀、無水乙醇、冰乙酸、氯化鈉等均為國產(chǎn)分

圖 3 PCR 擴(kuò)增 PEDV N 基因片段及 pEGEP-N 重組質(zhì)粒鑒定圖R amplification of PEDV N gene fragment and pEGEP-N recombinant plasmid identificA：M：DNAMarker； 1：PEDV N 基因片段；Marker；1：陰性對(duì)照；2：pEGEP-N 菌液 PCR 鑒定結(jié)果；3：pEGEP-N 菌液 PCRC：M：DNAMarker；1：pEGEP-N 質(zhì)粒酶切結(jié)果；2：pEGEP-N 質(zhì)粒酶切結(jié)果；A: M: DNAMarker; 1. PEDV N gene fragment;Marker; 1: negative control; 2: pEGEP-N bacterial solution PCR identification results; 3bacterial solution PCR identification results;: DNAMarker; 1: pEGEP-N plasmid digestion results; 2: pEGEP-N plasmid digestion re的分析STAR 軟件分析測(cè)序結(jié)果，測(cè)序獲得的 PEDV N 基因片段與 GDNA 序列的相似性為 100%，蛋白序列的相似性為 100%。EGFP-N 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞后的鑒定微鏡檢測(cè) pEGEP-N 蛋白的表達(dá) 重組質(zhì)粒在過生工測(cè)序后 DNASTAR 軟件分析證明該重組質(zhì)粒
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 鄭逢梅;霍金耀;趙軍;常洪濤;王曉夢(mèng);陳陸;王川慶;;2010～2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析[J];病毒學(xué)報(bào);2013年02期

2 石達(dá);呂茂杰;陳建飛;時(shí)紅艷;張志榜;馮力;;豬流行性腹瀉病毒蛋白對(duì)Vero E6核蛋白B23.1的影響[J];中國獸醫(yī)雜志;2012年04期

3 孫東波;馮力;時(shí)洪艷;陳建飛;;豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年10期

4 嚴(yán)晶;霍克克;;雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)及其在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2006年06期

5 魏亦男,李元宗,常文保,慈云祥;熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在生物分析中的應(yīng)用[J];分析化學(xué);1998年04期

本文編號(hào)：2869154