雞病毒性傳染性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)主要引起雞的消瘦、糞便過料、腺胃腫大等癥狀。該病最早在1978年由荷蘭科學(xué)家Kouwenhoven發(fā)現(xiàn),并蔓延至全世界各個國家。中國在1994年的江蘇省最先出現(xiàn),隨后在全國各省市呈爆發(fā)式流行。該病能夠顯著增加料肉比,降低雞肉的產(chǎn)量,給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已成為困擾肉雞養(yǎng)殖業(yè)的重要問題。盡管國內(nèi)外眾學(xué)者分離到多種相關(guān)病毒,如網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、呼腸孤病毒、J亞群禽白血病病毒、馬立克氏病病毒、雞傳染性貧血病毒、腺胃壞死病毒等,但均無法使用純病毒復(fù)制出該病,因此,雞TVP的病因一直未明。根據(jù)大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果及前人的研究,我們推測該病是由一種未知的新病毒引起。為了鑒定此未知病毒,本研究通過深入流行病學(xué)調(diào)查,排除現(xiàn)有已知的TVP相關(guān)病毒,篩選典型單感染TVP病例,建立TVP疾病模型,利用PacBio三代測序平臺進(jìn)行病毒宏基因組高通量測序,分離鑒定病毒,進(jìn)而研究病毒的致病機(jī)制。為臨床生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。為了獲得無現(xiàn)有已知TVP相關(guān)病毒感染的單純TVP病例,本研究通過流行病學(xué)調(diào)查,采集了80多個TVP發(fā)病雞場的336份樣品,通過大體剖檢及病理組織學(xué)檢測,對發(fā)病類型進(jìn)行歸納總結(jié),利用病理學(xué)方法進(jìn)行分類。從中篩選出病理組織學(xué)病變?yōu)轲つ雍拖俟荛g淋巴細(xì)胞浸潤的TVP病例。通過PCR檢測排除上述已知8種腺胃炎相關(guān)病毒的感染,并且接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基排除細(xì)菌感染。為排除無關(guān)病毒的干擾,確保后續(xù)病毒鑒定的準(zhǔn)確性。本研究以篩選出的病例的病料為原始材料回歸SPF雞,成功復(fù)制出TVP疾病模型,感染雞表現(xiàn)表現(xiàn)出典型TVP癥狀。再次對回歸動物進(jìn)行已知腺胃炎相關(guān)病毒的PCR檢測,檢測結(jié)果顯示8種已知TVP相關(guān)病毒均為陰性,排除已知相關(guān)病毒污染。為了鑒定病毒,首先通過電鏡觀察到病毒粒子的大小和形態(tài),發(fā)現(xiàn)病毒粒子呈圓形或二十面體對稱,無囊膜,直徑為26-28 nm。使用PacBio三代測序平臺進(jìn)行病毒宏基因組高通量測序,并與2017年NCBI最新病毒庫進(jìn)行BLAST比對。比對上的序列均顯示同一種病毒-圓圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)。使用反向PCR擴(kuò)增病毒全長序列,最終得到病毒的全長序列為2356 bp,將其命名為SDAU-1株。GyV3-SDAU-1株基因組中含有3個重疊的開放閱讀框,編碼三種蛋白,分別為衣殼蛋白VP1,骨架蛋白VP2,凋亡蛋白VP3。NCBI查找圓環(huán)病毒科和細(xì)環(huán)病毒科共30株病毒全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果顯示GyV3-SDAU-1與GyV3-FecGy同源關(guān)系最近,屬于細(xì)環(huán)病毒科圓圈病毒屬。GyV3為單鏈環(huán)狀DNA病毒,2012年首次在智利和香港發(fā)生急性胃腸炎的兒童糞便中分離鑒定,說明該病毒與胃腸炎關(guān)系密切,本研究首次從發(fā)生TVP的商品肉雞中檢測到GyV3,證實GyV3來源于雞。根據(jù)柯赫氏法則,需證明GyV3是否是引起TVP的主要原因。首先對采集的336份TVP病例和102份正常雞樣品,進(jìn)行了回顧性流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示,336份腺胃炎病例中GyV3陽性率為12.5%(42/336),在正常雞中未檢測到GyV3(0/102)。表明GyV3在TVP病例中普遍存在,而在健康雞體內(nèi)不存在。為了純化GyV3,體外培養(yǎng)雞胚腺胃原代細(xì)胞,并將GyV3感染雞腺胃組織處理后接種于雞胚腺胃原代細(xì)胞。收集接種GyV3的細(xì)胞,通過電子顯微鏡可以觀察到GyV3粒子,PCR檢測顯示GyV3為陽性,8種已知腺胃炎相關(guān)病毒均為陰性,說明病毒可以在腺胃原代細(xì)胞中復(fù)制,并且未污染其他病毒。然后將純培養(yǎng)的GyV3接種1日齡SPF雞,接毒雞表現(xiàn)消瘦、腺胃腫大、腺胃乳頭腫脹、腺胃黏膜層和固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤,呈現(xiàn)典型的TVP癥狀,并且從發(fā)病雞中能夠再次分離到GyV3,證明GyV3確實能夠引起雞的TVP。為明確GyV3的致病性及發(fā)病規(guī)律,將腺胃原代細(xì)胞培養(yǎng)的GyV3接種SPF雞,通過大體剖檢觀察和病理組織學(xué)觀察病變情況,表明雞腺胃組織從7日齡開始出現(xiàn)明顯炎癥,14-21日齡之后達(dá)到高峰,35日齡癥狀減輕,這與臨床生產(chǎn)中雞TVP的發(fā)病日齡吻合。接毒雞除表現(xiàn)典型的TVP癥外,還引起雞的貧血和免疫抑制癥狀。為明確GyV3的可能感染途徑,通過腹腔、靜脈、皮下、口服注射4種不同方式接種SPF雞,發(fā)現(xiàn)不同接種方式均表現(xiàn)出相同的病理變化和病程變化。說明GyV3可以經(jīng)多種途徑感染。為明確GyV3對不同日齡SPF雞的感染力,將GyV3接種不同日齡(7日齡、14日齡、21日齡、28日齡)SPF雞,結(jié)果顯示,不同日齡的雞均表現(xiàn)出相同的病理變化和病程變化,說明雞只對GyV3無日齡抗性,即GyV3可感染不同日齡的雞只。為了探究GyV3的發(fā)病機(jī)制,本研究研究通過絕對熒光定量PCR檢測8個時間段,29種雞組織器官內(nèi)的病毒含量。結(jié)果顯示,病毒含量最高的組織為腎上腺、骨髓,其次是神經(jīng)、卵巢和羽髓,而腺胃的病毒載量則相對較低。腎上腺和神經(jīng)高病毒含量表明其引起腺胃炎的原因可能是間接的,病毒入侵腎上腺和神經(jīng)后,導(dǎo)致體液調(diào)節(jié)和神經(jīng)調(diào)節(jié)的腺胃出現(xiàn)炎癥。而骨髓作為最大的造血器官,病毒入侵后,導(dǎo)致造血干細(xì)胞及早期免疫細(xì)胞發(fā)育不良,造成貧血和免疫抑制。為探索GyV3發(fā)病的分子機(jī)制,以GyV3的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)分析與其互作的宿主蛋白,結(jié)果顯示,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3、T細(xì)胞受體、胱天蛋白酶募集域蛋白9和酪蛋白激酶1四種蛋白可能分別參與了病毒入侵機(jī)體及逃避宿主免疫、機(jī)體對病毒的識別和信號傳遞、激活先天性免疫和特異性免疫等過程,說明GyV3感染改變了細(xì)胞的生物進(jìn)程,激活或抑制了一系列信號通路。綜上所述,本研究在大量臨床調(diào)查的基礎(chǔ)上,利用病毒宏基因組高通量測序的方法從無現(xiàn)有TVP相關(guān)病毒感染的、單純TVP病例中分離鑒定出一種新病毒,GyV3。并使用純培養(yǎng)的GyV3復(fù)制出TVP,證明GyV3是引起雞TVP的直接病因,同時GyV3也能夠引起貧血和免疫抑制。而GyV3誘導(dǎo)腺胃炎的原因可能是GyV3感染腎上腺和骨髓間接引起。此外,GyV3的結(jié)構(gòu)蛋白VP1主要通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3、胱天蛋白酶募集域蛋白9、酪蛋白激酶1和T細(xì)胞受體四種蛋白與宿主細(xì)胞發(fā)生互作以改變宿主細(xì)胞的生物進(jìn)程。我們的研究為后續(xù)GyV3的致病機(jī)制研究和TVP的防控提供了科學(xué)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

1.3.1 臨床癥狀腺胃炎主要能夠影響雞群的生長性能。發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、少食少水、體型消瘦、體重下降（圖1）(Goodwin et al., 1996)；在疾病中后期，發(fā)病雞還會表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉，且糞便中摻雜有大量的未消化的飼料(GR et al., 2001)；此外，發(fā)病較嚴(yán)重的雞的體重下降十分明顯、全身蒼白、體態(tài)差，最終可能會衰竭而亡(Goodwin et al.,1996;Huff et al., 2001)。圖1 受腺胃炎影響的肉雞(Noiva et al., 2015)Fig. 1 Broiler chickens affected with proventriculi

1.3.2 剖檢病變對發(fā)生腺胃炎的病雞進(jìn)行剖檢，可以發(fā)現(xiàn)明顯的腺胃腫大（圖1-2）(Adair et al., 1979)，有的病雞還表現(xiàn)為腺胃的蒼白（圖2）(JS and HJ, 1991; Guy et al., 1997)。剖開腺胃后，可觀察到腺胃乳頭腫脹，腺胃黏膜表面有顯著的白色壞死點(diǎn)，嚴(yán)重者還表現(xiàn)為腺胃乳頭的糜爛、出血甚至消失（圖2）(Noiva et al., 2015)。圖2 腺胃炎雞剖檢病變(Noiva et al., 2015)Fig. 2 Proventriculitischicken necropsy lesions注：a：嚴(yán)重腫大的腺胃和彌漫性蒼白的漿膜；b：切開腺胃的內(nèi)部；c：中度腫大的腺胃和彌漫性蒼白的漿膜；d：切開腺胃的內(nèi)部。Note: a: Severely enlarged proventriculus with diffuse pale serosa; b: cut surface of the proventricular wall;c: moderately enlarged proventriculus with mottled pale serosa; d: cut surface of the proventricular wall.1.3.3 組織學(xué)病變組織病理學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)，病雞表現(xiàn)出嚴(yán)重的腺體水腫、黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，腺管間單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤和炎癥反應(yīng)（圖 3）(Marusak et al., 2012; Bayyari et al.,1995b; Hess, 2000)。圖 3 腺胃炎雞病理組織學(xué)變化(Marguerie et al., 2011; Kim et al., 2015)Fig. 3Histopathological changes were observed in chicken with proventriculitis注：顯微鏡下顯示腺胃腺上皮壞死，脫落的細(xì)胞和嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤。H＆E。Note: Photomicrograph of a proventricular gland showing necrosis of the proventricular epithelium,sloughed cells, and severely lymphocytic infiltration

.3.3 組織學(xué)病變組織病理學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)，病雞表現(xiàn)出嚴(yán)重的腺體水腫、黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，間單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤和炎癥反應(yīng)（圖 3）(Marusak et al., 2012; Bayyari et995b; Hess, 2000)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2867948