豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)引起的以豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等臨床癥狀為特征的細(xì)菌性傳染病。副豬嗜血桿菌病(也稱為格拉澤氏病)是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的以豬的腦膜炎、多發(fā)性漿膜炎、心包炎和關(guān)節(jié)炎為特征的細(xì)菌性傳染病。二者在臨床上常見混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。疫苗是提倡無抗養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié),豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌血清型眾多,傳統(tǒng)的滅活苗型間交叉保護性差,隨著多種免疫原性好的抗原蛋白的發(fā)現(xiàn),亞單位疫苗逐漸受到人們的重視。細(xì)菌表面展示技術(shù)已被證實能將較大的外源片段展示于菌體表面且保持片段生物學(xué)活性。本研究的目的在于獲得一種基于細(xì)菌表面展示的高效、廉價、廣譜的豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)亞單位疫苗,為細(xì)菌疫苗的研發(fā)提供新思路。本研究構(gòu)建了重組表面展示質(zhì)粒pMD-INP-CdtB-OppA、pMD-INP-AfuA-OppA2、pMD-INP-MRP、pMD-INP-AfuA、pMD-INP-OppA2、pMD-INP-CdtB、pMD-INP-OppA,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),通過亞細(xì)胞組分分離定位、免疫電鏡實驗驗證了這8個重組的表面展示質(zhì)粒能將重組蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY、AfuA、CdtB、OppA2、OppA展示于E.coli BL21(DE3)的菌體表面。將菌體滅活后進行蛋白定量按比例混合并將混合后的菌液與ISA201VG乳化制成二聯(lián)亞單位疫苗,添加純化蛋白二聯(lián)亞單位疫苗組、二聯(lián)滅活苗組和對照組,在二次免疫小鼠14d后,用副豬嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株和豬鏈球菌血清2型M126株、血清9型GZ2株以絕對致死劑量分別對小鼠腹腔注射攻毒。結(jié)果顯示,表面展示HPS融合抗原蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA的亞單位疫苗I對攻副豬嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保護率為(80%、80%),表面展示HPS抗原蛋白AfuA、CdtB、OppA2、OppA的二聯(lián)疫苗Ⅱ?qū)ジ必i嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保護率為(90%、60%),證明將蛋白融合后再進行表面展示策略的可行性。同時,二者對攻HPS小鼠的保護效果優(yōu)于滅活苗(80%、60%),與純化蛋白亞單位疫苗基本相當(dāng)(90%、60%);含SS經(jīng)典抗原蛋白MRP、SLY的表面展示疫苗對攻SS血清2型M126株、血清9型GZ2株的小鼠的保護率為(50%、90%),低于純化蛋白亞單位疫苗(100%、80%),但高于滅活苗(50%、60%)。表面展示疫苗刺激小鼠機體產(chǎn)生細(xì)胞因子及抗體水平均與純化蛋白亞單位疫苗相當(dāng),其簡單的制作過程展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S859.797
【部分圖文】：

、rHP0197、rMRP、rRfeA、rSLY 的免疫原性，需要進行性佐劑 ISA201VG 按等質(zhì)量比混合后乳化，使乳化完成后再取 4 周齡雌性 KM 小鼠（體重為 21-24 g）60 只，隨機201VG 組、rHP0197+ISA201VG 組、rMRP+ISA201VG 組1VG 組共五個免疫組和對照組 PBS+ISA201VG 組，背部皮后 14 d 進行二次免疫，免疫劑量和方式與第一次免疫時d 時對各組小鼠進行斷尾采血，分離血清備用。同時用豬鏈 3×108cfu/只。觀察并統(tǒng)計一周內(nèi)小鼠的生存情況。因 PCR 擴增ZYH33 株基因組為模板，設(shè)計引物擴增 fbp、hp0197、mr驗證，結(jié)果顯示 fbp、hp0197、mrp、rfeA、sly 的條帶大小6 bp、1497 bp，符合預(yù)期。

重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.2-2recombinantplasmids’doubleenzymedigestion

圖 2-2 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.2-2 recombinant plasmids’ double enzyme digestionM:DL15000；1:pET-28a-FBP;2:pET-28a-HP0197;3:pET-28a-MRP;4:pET-28a-RfeA;5:pET-28a-SLY SS 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)驗證構(gòu)建的重組菌 BL21(DE3)-(pET-28a-FBP)、BL21(DE3)-(pET-22b-HP0197)、8a-MRP)、BL21(DE3)-(pET-28a-RfeA)、BL21(DE3)-(pET-28a-SLY) 誘導(dǎo)后收適量進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF膜，以商品化的鼠的His抗體為一抗進行W圖 2-3 顯示，證明蛋白能在重組菌內(nèi)被表達(dá)。
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本文編號：2867463