豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)引起的以豬的腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎等臨床癥狀為特征的細菌性傳染病。副豬嗜血桿菌病(也稱為格拉澤氏病)是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的以豬的腦膜炎、多發(fā)性漿膜炎、心包炎和關節(jié)炎為特征的細菌性傳染病。二者在臨床上常見混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。疫苗是提倡無抗養(yǎng)殖的關鍵環(huán)節(jié),豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌血清型眾多,傳統(tǒng)的滅活苗型間交叉保護性差,隨著多種免疫原性好的抗原蛋白的發(fā)現(xiàn),亞單位疫苗逐漸受到人們的重視。細菌表面展示技術已被證實能將較大的外源片段展示于菌體表面且保持片段生物學活性。本研究的目的在于獲得一種基于細菌表面展示的高效、廉價、廣譜的豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)亞單位疫苗,為細菌疫苗的研發(fā)提供新思路。本研究構建了重組表面展示質粒pMD-INP-CdtB-OppA、pMD-INP-AfuA-OppA2、pMD-INP-MRP、pMD-INP-AfuA、pMD-INP-OppA2、pMD-INP-CdtB、pMD-INP-OppA,并轉入E.coli BL21(DE3),通過亞細胞組分分離定位、免疫電鏡實驗驗證了這8個重組的表面展示質粒能將重組蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY、AfuA、CdtB、OppA2、OppA展示于E.coli BL21(DE3)的菌體表面。將菌體滅活后進行蛋白定量按比例混合并將混合后的菌液與ISA201VG乳化制成二聯(lián)亞單位疫苗,添加純化蛋白二聯(lián)亞單位疫苗組、二聯(lián)滅活苗組和對照組,在二次免疫小鼠14d后,用副豬嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株和豬鏈球菌血清2型M126株、血清9型GZ2株以絕對致死劑量分別對小鼠腹腔注射攻毒。結果顯示,表面展示HPS融合抗原蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA的亞單位疫苗I對攻副豬嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保護率為(80%、80%),表面展示HPS抗原蛋白AfuA、CdtB、OppA2、OppA的二聯(lián)疫苗Ⅱ對攻副豬嗜血桿菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保護率為(90%、60%),證明將蛋白融合后再進行表面展示策略的可行性。同時,二者對攻HPS小鼠的保護效果優(yōu)于滅活苗(80%、60%),與純化蛋白亞單位疫苗基本相當(90%、60%);含SS經(jīng)典抗原蛋白MRP、SLY的表面展示疫苗對攻SS血清2型M126株、血清9型GZ2株的小鼠的保護率為(50%、90%),低于純化蛋白亞單位疫苗(100%、80%),但高于滅活苗(50%、60%)。表面展示疫苗刺激小鼠機體產(chǎn)生細胞因子及抗體水平均與純化蛋白亞單位疫苗相當,其簡單的制作過程展現(xiàn)出很好的應用前景。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S859.797
【部分圖文】：

、rHP0197、rMRP、rRfeA、rSLY 的免疫原性，需要進行性佐劑 ISA201VG 按等質量比混合后乳化，使乳化完成后再取 4 周齡雌性 KM 小鼠（體重為 21-24 g）60 只，隨機201VG 組、rHP0197+ISA201VG 組、rMRP+ISA201VG 組1VG 組共五個免疫組和對照組 PBS+ISA201VG 組，背部皮后 14 d 進行二次免疫，免疫劑量和方式與第一次免疫時d 時對各組小鼠進行斷尾采血，分離血清備用。同時用豬鏈 3×108cfu/只。觀察并統(tǒng)計一周內小鼠的生存情況。因 PCR 擴增ZYH33 株基因組為模板，設計引物擴增 fbp、hp0197、mr驗證，結果顯示 fbp、hp0197、mrp、rfeA、sly 的條帶大小6 bp、1497 bp，符合預期。

重組質粒雙酶切驗證Fig.2-2recombinantplasmids’doubleenzymedigestion

圖 2-2 重組質粒雙酶切驗證Fig.2-2 recombinant plasmids’ double enzyme digestionM:DL15000；1:pET-28a-FBP;2:pET-28a-HP0197;3:pET-28a-MRP;4:pET-28a-RfeA;5:pET-28a-SLY SS 蛋白誘導表達驗證構建的重組菌 BL21(DE3)-(pET-28a-FBP)、BL21(DE3)-(pET-22b-HP0197)、8a-MRP)、BL21(DE3)-(pET-28a-RfeA)、BL21(DE3)-(pET-28a-SLY) 誘導后收適量進行SDS-PAGE并轉轉至PVDF膜，以商品化的鼠的His抗體為一抗進行W圖 2-3 顯示，證明蛋白能在重組菌內被表達。
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本文編號：2867463