豬嵴病毒(Porince Kobuvirus,PKV)是引起豬腹瀉的一種常見(jiàn)的腸道病毒,其中1周齡以內(nèi)仔豬易感率最高。感染豬群主要表現(xiàn)為精神萎靡、水樣腹瀉等臨床癥狀,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致脫水甚至死亡。目前,PKV的臨床診斷主要依靠于RT-PCR方法,但該檢測(cè)方法的靈敏度有限,毒量較低的樣品不能準(zhǔn)確檢出,容易出現(xiàn)漏檢。因此,建立一種具有更高敏感性、特異性以及快速檢測(cè)的臨床診斷方法就顯得格外重要。本研究以Basic RPA和LF-RPA為基礎(chǔ),結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳和側(cè)流層析免疫技術(shù),建立了PKV的臨床快速檢測(cè)方法,為今后PKV的臨床診斷及快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。具體試驗(yàn)結(jié)果如下:1.豬嵴病毒Basic RPA快速診斷方法的建立根據(jù)GenBank中公布的豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因組序列設(shè)計(jì)并合成Basic RPA特異性引物,構(gòu)建PKV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板建立檢測(cè)PKV的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)快速檢測(cè)方法,并對(duì)此方法的敏感性、特異性以及重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,以豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德?tīng)査跔畈《?PDCoV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)為模板時(shí)均未檢測(cè)到特異性擴(kuò)增條帶,而用不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)時(shí),均能擴(kuò)增出特異性條帶,該方法可檢測(cè)的最低限度為3.36×10~2copies/μL。上述結(jié)果表明,本研究成功建立了一種具有較高特異性、重復(fù)性和敏感性的PKV Basic RPA快速檢測(cè)方法。2.豬嵴病毒LF-RPA快速診斷方法的建立根據(jù)GenBank中已公布的豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因組序列設(shè)計(jì)并合成LF-RPA特異性引物和探針,構(gòu)建PKV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板建立LF-RPA快速檢測(cè)方法,并對(duì)該方法的特異性、重復(fù)性、敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,以TGEV、PEDV、FMDV、PRRSV、PDCoV為模板時(shí)試紙條均無(wú)檢測(cè)條帶出現(xiàn),測(cè)試結(jié)果呈陰性,證明該檢測(cè)方法具有很好的特異性。用不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),試紙條均出現(xiàn)檢測(cè)條帶,測(cè)試結(jié)果呈陽(yáng)性。其檢測(cè)的最低限度為3.36×10~2copies/μL。上述結(jié)果表明,本研究成功建立了一種具有較高特異性、重復(fù)性、敏感性的PKV LF-RPA快速檢測(cè)方法。3.豬嵴病毒Basic RPA和LF-RPA檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用利用本研究建立的快速檢測(cè)方法對(duì)2016—2017年從河南、新疆、黑龍江等地采集的276份豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)利用常規(guī)的RT-PCR方法進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。結(jié)果顯示,常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)出140份陽(yáng)性樣品,陽(yáng)性檢出率為50.7%,而利用本研究建立的Basic RPA方法檢測(cè)出162份陽(yáng)性樣品,陽(yáng)性檢出率為58.7%;利用LF-RPA方法檢測(cè)出154份陽(yáng)性樣品,陽(yáng)性檢出率為55.8%。此外,本研究建立的兩種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便,相較于常規(guī)RT-PCR更節(jié)省時(shí)間,適用于臨床大規(guī)模樣品檢測(cè)。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

36×104copies/μL。圖 3： RT-PCR 的檢測(cè)靈敏度結(jié)果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:陰性對(duì)照 NC:Negative control特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，從瓊脂現(xiàn)良好的特異性擴(kuò)增條帶，因此，可以證

3.2 敏感性試驗(yàn)3.2.1 PKV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品 Basic RPA 反應(yīng)的靈敏性從圖2中可以看出當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)在3.36×108-3.36×102copies/μL范圍內(nèi)均能檢測(cè)到特異性擴(kuò)增條帶，而且在 3.36×108copies/μL 時(shí)擴(kuò)增條帶最亮，在 3.36×102copies/μL 時(shí)擴(kuò)增條帶最弱，因此，可以確定的是，利用此方法得到的最低檢測(cè)限度為 3.36×102copies/μL。擴(kuò)增結(jié)果符合濃度梯度，而 3.36×101copies/μL 和對(duì)照組均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。

NC:陰性對(duì)照 NC:Negative control3.2.2 PKV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏性從圖3可以看出當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為3.36×104copies/μL 時(shí)能檢測(cè)到擴(kuò)增條帶，而在更低濃度和對(duì)照組均無(wú)特異性擴(kuò)增，表明利用該檢測(cè)方法得到的最低檢測(cè)限度是3.36×104copies/μL。圖 3： RT-PCR 的檢測(cè)靈敏度結(jié)果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:陰性對(duì)照 NC:Negative control3.3 特異性試驗(yàn)當(dāng)以6種病毒各自特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，從瓊脂糖凝膠電泳圖上可以看出，6種病毒均出現(xiàn)良好的特異性擴(kuò)增條帶，因此，可以證明6種病毒均為陽(yáng)性毒株。圖4：RT-PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Figure 4: Specificity results of RT-PCR
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本文編號(hào)：2865956