豬嵴病毒(Porince Kobuvirus,PKV)是引起豬腹瀉的一種常見的腸道病毒,其中1周齡以內仔豬易感率最高。感染豬群主要表現(xiàn)為精神萎靡、水樣腹瀉等臨床癥狀,嚴重時可導致脫水甚至死亡。目前,PKV的臨床診斷主要依靠于RT-PCR方法,但該檢測方法的靈敏度有限,毒量較低的樣品不能準確檢出,容易出現(xiàn)漏檢。因此,建立一種具有更高敏感性、特異性以及快速檢測的臨床診斷方法就顯得格外重要。本研究以Basic RPA和LF-RPA為基礎,結合瓊脂糖凝膠電泳和側流層析免疫技術,建立了PKV的臨床快速檢測方法,為今后PKV的臨床診斷及快速檢測提供了新的技術手段。具體試驗結果如下:1.豬嵴病毒Basic RPA快速診斷方法的建立根據GenBank中公布的豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因組序列設計并合成Basic RPA特異性引物,構建PKV陽性質粒標準品,以陽性標準品為模板建立檢測PKV的重組酶聚合酶擴增(RPA)快速檢測方法,并對此方法的敏感性、特異性以及重復性進行了評價。結果顯示,以豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)為模板時均未檢測到特異性擴增條帶,而用不同濃度的質粒標準品進行重復試驗時,均能擴增出特異性條帶,該方法可檢測的最低限度為3.36×10~2copies/μL。上述結果表明,本研究成功建立了一種具有較高特異性、重復性和敏感性的PKV Basic RPA快速檢測方法。2.豬嵴病毒LF-RPA快速診斷方法的建立根據GenBank中已公布的豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因組序列設計并合成LF-RPA特異性引物和探針,構建PKV陽性質粒標準品,以質粒標準品為模板建立LF-RPA快速檢測方法,并對該方法的特異性、重復性、敏感性進行了評價。結果顯示,以TGEV、PEDV、FMDV、PRRSV、PDCoV為模板時試紙條均無檢測條帶出現(xiàn),測試結果呈陰性,證明該檢測方法具有很好的特異性。用不同濃度的質粒標準品進行重復實驗,試紙條均出現(xiàn)檢測條帶,測試結果呈陽性。其檢測的最低限度為3.36×10~2copies/μL。上述結果表明,本研究成功建立了一種具有較高特異性、重復性、敏感性的PKV LF-RPA快速檢測方法。3.豬嵴病毒Basic RPA和LF-RPA檢測方法的臨床應用利用本研究建立的快速檢測方法對2016—2017年從河南、新疆、黑龍江等地采集的276份豬糞便樣品進行檢測,同時利用常規(guī)的RT-PCR方法進行對照檢測。結果顯示,常規(guī)RT-PCR方法檢測出140份陽性樣品,陽性檢出率為50.7%,而利用本研究建立的Basic RPA方法檢測出162份陽性樣品,陽性檢出率為58.7%;利用LF-RPA方法檢測出154份陽性樣品,陽性檢出率為55.8%。此外,本研究建立的兩種檢測方法操作簡便,相較于常規(guī)RT-PCR更節(jié)省時間,適用于臨床大規(guī)模樣品檢測。
【學位單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

36×104copies/μL。圖 3： RT-PCR 的檢測靈敏度結果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:陰性對照 NC:Negative control特異性引物進行RT-PCR擴增時，從瓊脂現(xiàn)良好的特異性擴增條帶，因此，可以證

3.2 敏感性試驗3.2.1 PKV 陽性標準品 Basic RPA 反應的靈敏性從圖2中可以看出當陽性質粒標準品的拷貝數(shù)在3.36×108-3.36×102copies/μL范圍內均能檢測到特異性擴增條帶，而且在 3.36×108copies/μL 時擴增條帶最亮，在 3.36×102copies/μL 時擴增條帶最弱，因此，可以確定的是，利用此方法得到的最低檢測限度為 3.36×102copies/μL。擴增結果符合濃度梯度，而 3.36×101copies/μL 和對照組均未出現(xiàn)特異性擴增條帶。

NC:陰性對照 NC:Negative control3.2.2 PKV 陽性標準品 RT-PCR 反應的靈敏性從圖3可以看出當陽性質粒標準品的拷貝數(shù)為3.36×104copies/μL 時能檢測到擴增條帶，而在更低濃度和對照組均無特異性擴增，表明利用該檢測方法得到的最低檢測限度是3.36×104copies/μL。圖 3： RT-PCR 的檢測靈敏度結果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:陰性對照 NC:Negative control3.3 特異性試驗當以6種病毒各自特異性引物進行RT-PCR擴增時，從瓊脂糖凝膠電泳圖上可以看出，6種病毒均出現(xiàn)良好的特異性擴增條帶，因此，可以證明6種病毒均為陽性毒株。圖4：RT-PCR特異性檢測結果Figure 4: Specificity results of RT-PCR
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本文編號：2865956