豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱豬藍(lán)耳病,是一種高度接觸性傳染病。該病具有高發(fā)病率、高致死率和持續(xù)性感染的特點(diǎn),是危害世界養(yǎng)豬業(yè)頭號(hào)疫病之一。造成PRRS持續(xù)性感染的因素很多,其中一個(gè)重要原因是其病原PRRSV(PRRS virus)進(jìn)化出多種策略拮抗宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答,包括抑制I型干擾素(type I interferons,type I IFNs)表達(dá)和推遲高水平促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生等。DNAX激活蛋白12(DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12)是免疫細(xì)胞中重要接頭蛋白。DAP12通常被相關(guān)受體募集活化,進(jìn)而招募并激活下游分子,從而介導(dǎo)不同的免疫學(xué)功能。本課題主要圍繞“DAP12在PRRSV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答的作用機(jī)制”開(kāi)展研究。研究?jī)?nèi)容主要分為以下三方面:第一部分DAP12在PRRSV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答中的功能本章節(jié)研究中,首先在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)中敲低DAP12,發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)I型干擾素和促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄,干擾素調(diào)控因子-3(IFN regulatory factor 3,IRF-3)磷酸化水平也明顯提高;在CRL-2843-CD163細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DAP12則會(huì)抑制上述細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活化。進(jìn)一步探索PRRSV是否利用DAP12-脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)信號(hào)通路抑制宿主細(xì)胞抗病毒促炎細(xì)胞應(yīng)答,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染增強(qiáng)DAP12-Syk通路活化(包括二者磷酸化及相互作用),敲低Syk或抑制Syk活性會(huì)增加PRRSV激發(fā)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。接下來(lái),研究了PRRSV感染中,DAP12-Syk通路對(duì)炎癥通路活化的影響。結(jié)果表明,在PAMs中敲低DAP12能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)ERK1/2、p38、NF-κB的活化;在CRL-2843-CD163細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)DAP12能抑制PRRSV激活的NF-κB通路(MAPKs通路的活化不受影響)。而在敲低Syk的細(xì)胞中,DAP12過(guò)表達(dá)不能發(fā)揮抑制功能。上述結(jié)果表明,PRRSV能夠利用DAP12拮抗IRF-3介導(dǎo)的IFNs應(yīng)答以及NF-κB介導(dǎo)的促炎細(xì)胞應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)有助于加深對(duì)PRRSV致病機(jī)制的了解。第二部分NMHC-IIA-DAP12在PRRSV抑制宿主細(xì)胞抗病毒炎癥應(yīng)答的作用機(jī)制研究非肌肉肌球重鏈蛋白IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA)是非肌肉肌球蛋白IIA(non-muscle myosin IIA,NM-IIA)亞基,參與細(xì)胞遷移、形態(tài)維持以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多重要生理學(xué)過(guò)程。此前研究表明NMHC-IIA可以參與PRRSV對(duì)細(xì)胞入侵。本章節(jié)首先通過(guò)免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)及質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)分析鑒定出NMHC-IIA是PRRSV感染早期DAP12顯著結(jié)合蛋白。隨后通過(guò)Co-IP和激光共聚焦顯微術(shù)確定了PRRSV感染促進(jìn)NMHC-IIA-DAP12-Syk三元復(fù)合物的形成。根據(jù)DAP12免疫接頭蛋白的特性,NMHC-IIA可能作為受體通過(guò)偶聯(lián)DAP12發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,因此下一步確定NMHC-IIA在PRRSV感染早期的作用及其作用機(jī)制。進(jìn)一步利用pulldown證實(shí),NMHC-IIA和DAP12互作依賴于NMHC-IIA羧基端非螺旋區(qū)和DAP12跨膜區(qū)50-57位氨基酸的結(jié)合。隨后發(fā)現(xiàn),NMHC-IIA通過(guò)識(shí)別PRRSV糖蛋白5(glycoprotein 5,GP5)表面唾液酸修飾活化DAP12-Syk通路,抑制NF-κB/MAPKs通路介導(dǎo)的促炎細(xì)胞應(yīng)答。利用另一種唾液酸修飾RNA病毒-水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)證實(shí)該病毒可以被NMHC-IIA識(shí)別,從而激活DAP12-Syk通路抑制宿主細(xì)胞促炎細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)生。以上結(jié)果揭示出唾液酸化修飾RNA病毒利用NMHC-IIA-DAP12-Syk通路拮抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)的新策略。更重要的是,唾液酸類似物同樣可以激活該通路抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下NF-κB介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答。NMHC-IIA對(duì)炎癥應(yīng)答的負(fù)調(diào)控可能是免疫細(xì)胞中普遍存在的調(diào)節(jié)機(jī)制,是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要手段之一,也可能是新的潛在抗炎藥物靶點(diǎn)。第三部分poSn-DAP12在PRRSV抑制宿主細(xì)胞I型干擾素應(yīng)答中的作用機(jī)制研究豬唾液酸黏附素(porcine sialoadhesin,poSn)也被稱為唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-1(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin-1,Siglec-1),曾被認(rèn)為是PRRSV入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體之一。最近有報(bào)道稱poSn基因敲除豬對(duì)PRRSV仍易感,提示poSn可能在PRRSV感染中發(fā)揮其他作用。本章節(jié)研究發(fā)現(xiàn),PRRSV感染晚期通過(guò)IFN-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)通路誘導(dǎo)poSn上調(diào)。poSn隨后抑制PRRSV感染中I型干擾素的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究表明,PRRSV感染能增強(qiáng)poSn和DAP12的相互作用,poSn-DAP12通路參與拮抗NF-κB和IRF-3介導(dǎo)的IFNs應(yīng)答。本研究從一個(gè)全新的角度重新解釋了poSn在PRRSV感染中的作用。綜上所述,PRRSV感染中DAP12作為重要的免疫接頭蛋白,偶聯(lián)不同的受體蛋白,參與對(duì)宿主細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答的抑制。其中,在PRRSV感染早期,NMHCIIA通過(guò)識(shí)別病毒表面唾液酸修飾,募集并活化DAP12-Syk通路,抑制抗病毒炎癥反應(yīng);在PRRSV感染晚期,poSn通過(guò)偶聯(lián)DAP12參與拮抗抗病毒干擾素應(yīng)答。此外,NMHC-IIA-DAP12-Syk通路抑制LPS激活的促炎細(xì)胞應(yīng)答;poSn-DAP12通路抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了對(duì)宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控機(jī)制的理解,為PRRSV及其它唾液酸化RNA病毒的防控提供新的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 1-2 PRRSV 抑制 I 型干擾素應(yīng)答Figure1-2 PRRSV inhibits type I IFN responses (Sun, Han et al. 2012)1.1.2.2 PRRSV 拮抗宿主促炎細(xì)胞應(yīng)答促炎細(xì)胞應(yīng)答作為天然免疫應(yīng)答重要的組成部分，可以抑制病毒復(fù)制并阻止其機(jī)會(huì)致病菌的“趁虛而入”(Medzhitov 2010)。病毒入侵細(xì)胞會(huì)引起 NF-κB 和 ERK1/2p38 和 JNK MAPK 等蛋白激酶的活化，最終誘導(dǎo)白介素（interleukin，IL）-6、IL-8IL-1β 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等促炎細(xì)胞細(xì)胞因子的大量生。PRRSV 在豬體內(nèi)感染會(huì)推遲促炎細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)生，具體表現(xiàn)為豬在感染 PRRS后第七天才檢測(cè)到高水平炎癥因子的釋放。這提示，PRRSV發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用幫助病毒持續(xù)感染的建立 (Gomez-Laguna, Salguero et al. 2010, Zhang, Liu et al. 2013)例如，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRRSV 能夠抑制豬體內(nèi) TNF-α 的分泌 (Gomez-Laguna,Salgueet al. 2010)。體外試驗(yàn)則證明，PRRSV 抑制 LPS 和佛波酯（phorbol myristate acetatePMA）誘導(dǎo) TNF-α 的產(chǎn)生 (Lopez-Fuertes, Campos et al. 2000, Hou, Wang et al. 2012)在漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoiddendriticcells，pDCs）中，PRRSV 同樣可以選

PRRs之間的交互調(diào)節(jié)(引自(TakeuchiandAkira2009))

圖 1-8 常見(jiàn)的 CLRs（引自(Brown, Willment et al. 2018)）Figure 1-8 Representative C-type lectins (Brown, Willment et al. 2018)CLRs 介導(dǎo)通路的活化主要依賴于免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM）。ITAMs 可以作為某些 CLR（比如 dectin1 和DNGR1）的胞內(nèi)尾巴直接傳遞信號(hào)；也可以存在于信號(hào)通路接頭蛋白中接收來(lái)自 CLRs的信號(hào)。例如含有 ITAM 基序的 Fc 受體 γ-鏈（Fcreceptorγ-chain，F(xiàn)cRγ）可以被 dectin2、巨噬細(xì)胞 C 型凝集素（macrophageC-typelectin，MCL）或巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo) C 型凝集素（macrophage-inducible C-type lectin，mincle）所募集；人源 DAP10 或鼠源 DAP12 則可以被 CLEC5A、肝臟和淋巴竇內(nèi)皮細(xì)胞 C 型凝集素（liver and lymph node sinusoidalendothelialcellC-typelectin，LSECtin）或 NKG2D 等 CLRs 所募集。在骨髓細(xì)胞中，這些 ITAMs 能夠募集 Syk（在 T 細(xì)胞中則是募集酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-proteinkinase，ZAP70 ））， 隨 后 誘 導(dǎo) 接 頭 蛋 白 CARD9-B 細(xì) 胞 淋 巴 瘤 / 白 血 病 10 （ B-celllymphoma/leukemia 10，BCL-10）-粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)位蛋白 1（mucosa-associatedlymphoidtissuelymphomatranslocationprotein1，MALT1）復(fù)合物的形成，最
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