發(fā)布時間：2020-11-02 05:38

　　 豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱豬藍耳病,是一種高度接觸性傳染病。該病具有高發(fā)病率、高致死率和持續(xù)性感染的特點,是危害世界養(yǎng)豬業(yè)頭號疫病之一。造成PRRS持續(xù)性感染的因素很多,其中一個重要原因是其病原PRRSV(PRRS virus)進化出多種策略拮抗宿主細胞天然免疫應(yīng)答,包括抑制I型干擾素(type I interferons,type I IFNs)表達和推遲高水平促炎細胞因子誘導產(chǎn)生等。DNAX激活蛋白12(DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12)是免疫細胞中重要接頭蛋白。DAP12通常被相關(guān)受體募集活化,進而招募并激活下游分子,從而介導不同的免疫學功能。本課題主要圍繞“DAP12在PRRSV調(diào)節(jié)宿主細胞抗病毒天然免疫應(yīng)答的作用機制”開展研究。研究內(nèi)容主要分為以下三方面:第一部分DAP12在PRRSV調(diào)節(jié)宿主細胞天然免疫應(yīng)答中的功能本章節(jié)研究中,首先在豬肺泡巨噬細胞(PAMs)中敲低DAP12,發(fā)現(xiàn)能增強PRRSV誘導I型干擾素和促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄,干擾素調(diào)控因子-3(IFN regulatory factor 3,IRF-3)磷酸化水平也明顯提高;在CRL-2843-CD163細胞中過表達DAP12則會抑制上述細胞因子轉(zhuǎn)錄活化。進一步探索PRRSV是否利用DAP12-脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)信號通路抑制宿主細胞抗病毒促炎細胞應(yīng)答,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染增強DAP12-Syk通路活化(包括二者磷酸化及相互作用),敲低Syk或抑制Syk活性會增加PRRSV激發(fā)促炎細胞因子的產(chǎn)生。接下來,研究了PRRSV感染中,DAP12-Syk通路對炎癥通路活化的影響。結(jié)果表明,在PAMs中敲低DAP12能增強PRRSV誘導ERK1/2、p38、NF-κB的活化;在CRL-2843-CD163細胞中,過表達DAP12能抑制PRRSV激活的NF-κB通路(MAPKs通路的活化不受影響)。而在敲低Syk的細胞中,DAP12過表達不能發(fā)揮抑制功能。上述結(jié)果表明,PRRSV能夠利用DAP12拮抗IRF-3介導的IFNs應(yīng)答以及NF-κB介導的促炎細胞應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)有助于加深對PRRSV致病機制的了解。第二部分NMHC-IIA-DAP12在PRRSV抑制宿主細胞抗病毒炎癥應(yīng)答的作用機制研究非肌肉肌球重鏈蛋白IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA)是非肌肉肌球蛋白IIA(non-muscle myosin IIA,NM-IIA)亞基,參與細胞遷移、形態(tài)維持以及信號轉(zhuǎn)導等眾多重要生理學過程。此前研究表明NMHC-IIA可以參與PRRSV對細胞入侵。本章節(jié)首先通過免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)及質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)分析鑒定出NMHC-IIA是PRRSV感染早期DAP12顯著結(jié)合蛋白。隨后通過Co-IP和激光共聚焦顯微術(shù)確定了PRRSV感染促進NMHC-IIA-DAP12-Syk三元復合物的形成。根據(jù)DAP12免疫接頭蛋白的特性,NMHC-IIA可能作為受體通過偶聯(lián)DAP12發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,因此下一步確定NMHC-IIA在PRRSV感染早期的作用及其作用機制。進一步利用pulldown證實,NMHC-IIA和DAP12互作依賴于NMHC-IIA羧基端非螺旋區(qū)和DAP12跨膜區(qū)50-57位氨基酸的結(jié)合。隨后發(fā)現(xiàn),NMHC-IIA通過識別PRRSV糖蛋白5(glycoprotein 5,GP5)表面唾液酸修飾活化DAP12-Syk通路,抑制NF-κB/MAPKs通路介導的促炎細胞應(yīng)答。利用另一種唾液酸修飾RNA病毒-水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)證實該病毒可以被NMHC-IIA識別,從而激活DAP12-Syk通路抑制宿主細胞促炎細胞應(yīng)答的發(fā)生。以上結(jié)果揭示出唾液酸化修飾RNA病毒利用NMHC-IIA-DAP12-Syk通路拮抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)的新策略。更重要的是,唾液酸類似物同樣可以激活該通路抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下NF-κB介導的炎癥應(yīng)答。NMHC-IIA對炎癥應(yīng)答的負調(diào)控可能是免疫細胞中普遍存在的調(diào)節(jié)機制,是機體維持穩(wěn)態(tài)的重要手段之一,也可能是新的潛在抗炎藥物靶點。第三部分poSn-DAP12在PRRSV抑制宿主細胞I型干擾素應(yīng)答中的作用機制研究豬唾液酸黏附素(porcine sialoadhesin,poSn)也被稱為唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-1(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin-1,Siglec-1),曾被認為是PRRSV入侵宿主細胞的關(guān)鍵受體之一。最近有報道稱poSn基因敲除豬對PRRSV仍易感,提示poSn可能在PRRSV感染中發(fā)揮其他作用。本章節(jié)研究發(fā)現(xiàn),PRRSV感染晚期通過IFN-信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)通路誘導poSn上調(diào)。poSn隨后抑制PRRSV感染中I型干擾素的產(chǎn)生。進一步研究表明,PRRSV感染能增強poSn和DAP12的相互作用,poSn-DAP12通路參與拮抗NF-κB和IRF-3介導的IFNs應(yīng)答。本研究從一個全新的角度重新解釋了poSn在PRRSV感染中的作用。綜上所述,PRRSV感染中DAP12作為重要的免疫接頭蛋白,偶聯(lián)不同的受體蛋白,參與對宿主細胞抗病毒天然免疫應(yīng)答的抑制。其中,在PRRSV感染早期,NMHCIIA通過識別病毒表面唾液酸修飾,募集并活化DAP12-Syk通路,抑制抗病毒炎癥反應(yīng);在PRRSV感染晚期,poSn通過偶聯(lián)DAP12參與拮抗抗病毒干擾素應(yīng)答。此外,NMHC-IIA-DAP12-Syk通路抑制LPS激活的促炎細胞應(yīng)答;poSn-DAP12通路抑制poly(I:C)誘導的I型干擾素的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)擴展了對宿主細胞天然免疫應(yīng)答負調(diào)控機制的理解,為PRRSV及其它唾液酸化RNA病毒的防控提供新的理論依據(jù)。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 1-2 PRRSV 抑制 I 型干擾素應(yīng)答Figure1-2 PRRSV inhibits type I IFN responses (Sun, Han et al. 2012)1.1.2.2 PRRSV 拮抗宿主促炎細胞應(yīng)答促炎細胞應(yīng)答作為天然免疫應(yīng)答重要的組成部分，可以抑制病毒復制并阻止其機會致病菌的“趁虛而入”(Medzhitov 2010)。病毒入侵細胞會引起 NF-κB 和 ERK1/2p38 和 JNK MAPK 等蛋白激酶的活化，最終誘導白介素（interleukin，IL）-6、IL-8IL-1β 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等促炎細胞細胞因子的大量生。PRRSV 在豬體內(nèi)感染會推遲促炎細胞應(yīng)答的發(fā)生，具體表現(xiàn)為豬在感染 PRRS后第七天才檢測到高水平炎癥因子的釋放。這提示，PRRSV發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用幫助病毒持續(xù)感染的建立 (Gomez-Laguna, Salguero et al. 2010, Zhang, Liu et al. 2013)例如，體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，PRRSV 能夠抑制豬體內(nèi) TNF-α 的分泌 (Gomez-Laguna,Salgueet al. 2010)。體外試驗則證明，PRRSV 抑制 LPS 和佛波酯（phorbol myristate acetatePMA）誘導 TNF-α 的產(chǎn)生 (Lopez-Fuertes, Campos et al. 2000, Hou, Wang et al. 2012)在漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoiddendriticcells，pDCs）中，PRRSV 同樣可以選

PRRs之間的交互調(diào)節(jié)(引自(TakeuchiandAkira2009))

圖 1-8 常見的 CLRs（引自(Brown, Willment et al. 2018)）Figure 1-8 Representative C-type lectins (Brown, Willment et al. 2018)CLRs 介導通路的活化主要依賴于免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM）。ITAMs 可以作為某些 CLR（比如 dectin1 和DNGR1）的胞內(nèi)尾巴直接傳遞信號；也可以存在于信號通路接頭蛋白中接收來自 CLRs的信號。例如含有 ITAM 基序的 Fc 受體 γ-鏈（Fcreceptorγ-chain，F(xiàn)cRγ）可以被 dectin2、巨噬細胞 C 型凝集素（macrophageC-typelectin，MCL）或巨噬細胞可誘導 C 型凝集素（macrophage-inducible C-type lectin，mincle）所募集；人源 DAP10 或鼠源 DAP12 則可以被 CLEC5A、肝臟和淋巴竇內(nèi)皮細胞 C 型凝集素（liver and lymph node sinusoidalendothelialcellC-typelectin，LSECtin）或 NKG2D 等 CLRs 所募集。在骨髓細胞中，這些 ITAMs 能夠募集 Syk（在 T 細胞中則是募集酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-proteinkinase，ZAP70 ））， 隨 后 誘 導 接 頭 蛋 白 CARD9-B 細 胞 淋 巴 瘤 / 白 血 病 10 （ B-celllymphoma/leukemia 10，BCL-10）-粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)位蛋白 1（mucosa-associatedlymphoidtissuelymphomatranslocationprotein1，MALT1）復合物的形成，最
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙姬;;走出對病毒認知的5個誤區(qū)[J];生物學教學;2017年03期

2 王彬;許永慶;劉順洲;;高考生物實驗設(shè)計題如何考——對2017年全國理綜乙卷第29題的討論[J];中學生物教學;2017年15期

3 ;巨型病毒點燃進化樹之爭[J];生物進化;2017年02期

4 劉挺,管遠志;內(nèi)在化的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導宿主細胞凋亡[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年07期

5 朱炳法;防治AIDS的新動向[J];上海第二醫(yī)科大學學報;1988年03期

6 蔡威特;沈瓊;;漢遜酵母宿主細胞蛋白抗體制備的研究[J];食品與發(fā)酵科技;2017年04期

7 袁慧;聞良珍;;金葉敗毒制劑對人巨細胞病毒感染宿主細胞周期的調(diào)節(jié)作用[J];中國婦幼保健;2010年22期

8 姜宏,聞良珍;人巨細胞病毒感染誘導宿主細胞凋亡的實驗研究[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2002年01期

9 姜宏,聞良珍;人巨細胞病毒感染誘導宿主細胞凋亡的實驗研究[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2001年04期

10 李晨瀟;黃新華;何思為;王德成;;病原體調(diào)控宿主細胞周期致病機制的研究進展[J];微生物與感染;2011年01期

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 王子龍;代謝型谷氨酸受體2型作為狂犬病病毒入侵宿主細胞受體的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2018年

2 劉迎琦;DAP12在PRRSV抑制宿主細胞天然免疫應(yīng)答中的作用機制研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

3 趙鴻遠;豬偽狂犬病病毒體外下調(diào)宿主細胞SLA-Ⅰ的分子機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2018年

4 徐之勇;死亡受體接頭蛋白在E.tenella宿主細胞凋亡中的作用及機理[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2017年

5 馬曉霞;宿主細胞對小反芻獸疫病毒天然免疫應(yīng)答機制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2018年

6 王琳;J亞群禽白血病病毒與宿主細胞相互作用機制研究[D];揚州大學;2018年

7 馮敏;家蠶核型多角體病毒入侵宿主機制及囊膜融合蛋白GP64與宿主蛋白的互作研究[D];浙江大學;2018年

8 張昆;兼性胞內(nèi)寄生菌HLK1～T對人宿主細胞的感染和持續(xù)性寄生的研究[D];浙江大學;2006年

9 李林;以裂殖酵母為模型研究HIV蛋白與宿主細胞的相互作用并探索抗HIV-1的新策略[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2006年

10 郭嵐;宿主細胞內(nèi)SARS-CoV S蛋白和N蛋白的初步篩選和鑒定[D];山東大學;2006年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 查振中;副溶血弧菌效應(yīng)蛋白VPA1324調(diào)控宿主細胞免疫應(yīng)答研究[D];浙江理工大學;2018年

2 吳瓊;抗體藥中宿主細胞蛋白含量測定新方法研究[D];廣東藥科大學;2018年

3 陳玉禮;參與HIV-1 Tat激活KSHV裂解復制周期的宿主細胞甲基化基因篩選[D];右江民族醫(yī)學院;2018年

4 王睿升;AcMNPV及宿主細胞Sf9中增殖細胞核抗原PCNA的功能研究[D];山西大學;2018年

5 臧翔;基于序列非比對法的病毒感染特定宿主細胞的可能性評估研究[D];華南理工大學;2018年

6 張文超;豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP12與宿主細胞互作蛋白的篩選及鑒定[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2017年

7 姜詩晨;剛地弓形蟲入侵宿主細胞過程中棒狀體蛋白16的分泌與分布[D];南方醫(yī)科大學;2016年

8 江雯;登革病毒2型及其E蛋白與宿主細胞氧化還原狀態(tài)的關(guān)系[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

9 王冠;桿狀病毒早期感染對家蠶血淋巴細胞的影響以及宿主細胞的應(yīng)激反應(yīng)研究[D];南京師范大學;2004年

10 田衍平;登革病毒及其部分蛋白對宿主細胞氧化還原狀態(tài)影響的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2007年

本文編號：2866642