雞球蟲病是雞球蟲寄生在雞的小腸及盲腸上皮細胞內(nèi)引起的的專性寄生蟲病,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前藥物防治和疫苗預(yù)防措施均無法使防治球蟲病達到理想的效果。因此,尋找抗原性較好的蛋白去研制廉價高效的新型疫苗成為防治球蟲病的關(guān)鍵。本研究中ETH_00009450是通過蛋白質(zhì)組學分析篩選出,并分析到該基因在雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)入侵DF1細胞時其表達量上調(diào)了1.569倍,本研究選取此基因開展研究。首先對EtCaBP基因進行一系列生物學分析,從該基因的氨基酸序列二級及三級結(jié)構(gòu)的分析顯示該基因表達蛋白為鈣結(jié)合蛋白(CaBP),具有特征性的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,它們能與鈣離子發(fā)生作用,在細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導及鈣穩(wěn)態(tài)等各種生命活動機制中發(fā)揮重要作用。因此推測該基因是否與球蟲入侵宿主細胞相關(guān),從而研究該蛋白的免疫原性,為研究防治雞球蟲病新型疫苗提供候選蛋白的篩選。對EtCaBP(Eimeria tenella鈣結(jié)合蛋白)生物學信息分析后,本研究通過PCR擴增獲取基因片段,經(jīng)再經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ酶切后克隆至原核表達載體pET32a-EtCaBP,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌BL21(DE3)菌株中,經(jīng)IPTG誘導表達并純化EtCaBP蛋白,制備亞單位疫苗,免疫小鼠后制備出鼠源多克隆抗體。構(gòu)建酵母表面展示系統(tǒng)將EtCaBP蛋白展示在酵母表面,鑒定制備的多克隆抗體。本研究通過雞球蟲感染試驗對EtCaBP亞單位疫苗的免疫效果進行了評價,從而探究EtCaBP蛋白的免疫原性。將120只個體差異不大的雛雞隨機分成A組(EtCaBP免疫接種球蟲組)、B(EtCaBP免疫不接種球蟲組)、C(不免疫接種球蟲組)、D組(不免疫不接種球蟲組),每組30只。7日齡時,用完全弗氏佐劑乳化后的蛋白對A、B兩組進行頸部皮下多點注射免疫,免疫量為100ug/只,C、D兩組注射等量PBS;14日齡時,用不完全弗氏佐劑乳化蛋白進行第二次加強免疫,免疫方法同7日齡;21日齡時,對A、C兩組接種10000個新鮮的E.tenella孢子化卵囊。結(jié)果表明EtCaBP蛋白無跨膜區(qū)但具有信號肽序列,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示主要以α螺旋為主,含有5個EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu),通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)與CBP40(Physarum polycephalum特異性Ca~(2+)結(jié)合蛋白LAV1-2)結(jié)構(gòu)相似,相似度為66%。本研究成功克隆出EtCaBP基因,并構(gòu)建原核表達載體表達出可溶性蛋白,純化蛋白成功制備鼠源多克隆抗體。31日齡,整理數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析,通過對比組間的體重增長、相對增重率、卵囊排出量、盲腸病值、抗球蟲指數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化、細胞因子熒光定量分析等指標對EtCaBP亞單位疫苗的免疫保護效果進行了評價。EtCaBP免疫接種組的相對增重率、卵囊值、盲腸病變值和抗球蟲指數(shù)分別為88.9%、10、23.7、155.20。結(jié)果顯示EtCaBP蛋白免疫后一定程度上可以減少E.tenella感染對雞體重增長的抑制作用,減少卵囊排出量和減輕病變程度,抗球蟲效果是有效的。綜上所述,EtCaBP蛋白具有鈣結(jié)合蛋白的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,具有一定的免疫原性,對雞感染球蟲有一定的免疫保護作用。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.723
【部分圖文】：

典型鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)域中常見氨基酸（ZhouYetal.,2006）

圖 2 典型鈣結(jié)合蛋白 EF 手型結(jié)構(gòu)域中常見氨基酸（Zhou Y et al., 2006）Fig2 Consensus sequence of canonical Ca2+binding protein EF-hands對來自寄生原蟲溶組織阿米巴（Entamoeba histolytica）的 EhCaBP6 及其它分子鈣結(jié)合蛋白進行氨基酸序列比對，總結(jié)了溶組織阿米巴原蟲 12 種鈣結(jié)合蛋白 EF 構(gòu)域中常見氨基酸的分布規(guī)律，X、Y、Z、-Y、-X、-Z 分別位于結(jié)構(gòu)域環(huán)狀結(jié)、3、5、7、9、12 位氨基酸殘基上，以 I 型 EF 手型結(jié)構(gòu)為例，可見 1(X)、3(Y))大多為 D 天冬酰胺；9(-X) 大多為 S 絲氨酸或 T 蘇氨酸，12(-Z)大多為 E 谷氨酸Ⅲ、Ⅳ型 EF 手型結(jié)構(gòu)的重要氨基酸分布略有不同。EhCaBP6 在溶組織阿米巴原分裂時分布于細胞間橋，在分裂間期位于多極微管束的末端（Grewal J S et al., 201

實驗動物i TOP10 用于重組質(zhì)粒的篩選，BL21（DE3）菌株用存；釀酒酵母 EBY100 [MATa GAL1-AGA1::URA3::HIS2 prb1Δ1.6R can1 GAL]和酵母表達載體 pCTC 教授饋贈。E. tenella 分離株（E. tenella SD-01）由無球蟲感染雞擴增、復(fù)壯。試驗小白鼠購自泰邦生蘭褐公雛購自泰安市東岳種禽廠。酶和試劑的所有引物均由上海生工生物有限公司合成。全式金生物公司，載體 pEASY-T1 質(zhì)粒圖譜如圖 4
【參考文獻】

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1 魏梅梅;熊雅念;洪煬;黃莉妮;孟培培;艾德宙;張旻;傅志強;劉升發(fā);林矯矯;;日本血吸蟲SjIrV1的基因特性及免疫保護效果[J];生物工程學報;2013年07期

2 鄒豐才;姜悅平;聶奎;商云霞;李海龍;;雛雞免疫堆型艾美球蟲后外周血T淋巴細胞亞群CD_4~+T和CD_8~+T的動態(tài)變化[J];養(yǎng)禽與禽病防治;2006年01期

本文編號：2865709