沙門(mén)菌(Salmonella)是腸桿菌科中最常見(jiàn)的病菌原之一,常寄生于動(dòng)物和人的腸道內(nèi),是引起人類(lèi)食物中毒最主要的病原菌。本研究分離鑒定了徐州及周邊地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)鴨、禽病門(mén)診病鴨、菜場(chǎng)和超市里鴨肉及副產(chǎn)品中沙門(mén)菌,通過(guò)血清型分型、ERIC-PCR分子分型方法分析沙門(mén)菌的分布情況;進(jìn)一步對(duì)分離的鴨源沙門(mén)菌的耐藥性和耐藥表型進(jìn)行研究;建立fimA-LAMP檢測(cè)方法,并在臨床上進(jìn)行驗(yàn)證;此外篩選了針對(duì)鴨源沙門(mén)菌的中藥復(fù)方制劑,希望可對(duì)鴨沙門(mén)菌病的防控提供理論和技術(shù)支持。1.鴨源沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)、鑒定、血清型分型及ERIC-PCR分子分型本研究從徐州及周邊地區(qū)采集6個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)的380份肉鴨泄殖腔肛拭子樣品、禽病門(mén)診50例臨床發(fā)病鴨的臟器組織、市場(chǎng)的300份鴨肉及副產(chǎn)品樣品,利用經(jīng)典分離方法,結(jié)合PCR驗(yàn)證,共分離到56株沙門(mén)菌。從鴨場(chǎng)分離到26株沙門(mén)菌,分離率為6.84%;其中24株沙門(mén)菌屬于4個(gè)血清型,分別為鼠傷寒沙門(mén)菌2株(8.33%),印第安納沙門(mén)菌4株(16.67%),鴨沙門(mén)菌2株(8.33%);腸炎沙門(mén)菌16株(66.67%),優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門(mén)菌。臨床發(fā)病鴨分離到24株沙門(mén)菌,分離率為48%;分為6個(gè)血清型,鼠傷寒沙門(mén)菌3株(12.5%),阿貢納沙門(mén)菌2株(8.33%),波茨坦沙門(mén)菌2株(8.33%),印第安納沙門(mén)菌10株(41.67%),鴨沙門(mén)菌1株(4.17%);腸炎沙門(mén)菌6株(25.0%),其中優(yōu)勢(shì)血清型為印第安納沙門(mén)菌。市場(chǎng)共分離到6株沙門(mén)菌,分離率為2%;其中5株分為兩個(gè)血清型,腸炎沙門(mén)菌4株(80%)、1株為印第安納沙門(mén)菌(20%),優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門(mén)菌。對(duì)其中21株沙門(mén)菌進(jìn)行ERIC-PCR分子分型,分成18個(gè)基因型,遺傳相似性在59%～100%之間,結(jié)果顯示出良好的多態(tài)性并獲得了較好的指紋圖譜數(shù)據(jù)。2.鴨源沙門(mén)菌耐藥性檢測(cè)及耐藥基因的分析用Kirby-Bauer(K-B)法測(cè)定分離的56株鴨沙門(mén)菌對(duì)20種抗菌藥物的耐藥性。合成19對(duì)引物,對(duì)6大類(lèi)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。分離的沙門(mén)菌對(duì)20種抗生素具有不同的耐藥率和多重耐藥現(xiàn)象,對(duì)鏈霉素耐藥率最高(98.2%),其次是氨芐青霉素(94.6%),耐藥表型主要為AStAC、ANStOCSx和AAKDOCSx。檢測(cè)的19種耐藥基因中,blaTEM-1、aadA1、aadA2、aph(3')-Ⅱa、tetA、gyrA、Sul2、drfⅫ基因的檢出率超過(guò)50%以上,其中aadA1基因檢出率最高(91.1%),其次是blaTEM-1基因(83.9%),沒(méi)有檢測(cè)到tetC基因�？股啬退幓驒z測(cè)與耐藥表型基本相符。3.基于fimA基因的鴨源沙門(mén)菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用以fimA菌毛基因?yàn)闄z測(cè)靶基因,設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,建立快速檢測(cè)沙門(mén)菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行一系列優(yōu)化,包括反應(yīng)溫度、檢測(cè)特異性和靈敏度等,并將LAMP與常規(guī)PCR進(jìn)行比較,用建立的方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:LAMP方法最適反應(yīng)溫度為64℃,Mg2+濃度為8mmol/L、dNTPs濃度為0.8mmol/L、內(nèi)外引物濃度比為1:8。對(duì)6種相關(guān)腸道細(xì)菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,僅沙門(mén)菌擴(kuò)增陽(yáng)性。對(duì)沙門(mén)菌檢測(cè)的靈敏度為8.6×l01cfu/mL,比PCR靈敏10倍。運(yùn)用建立的方法對(duì)市場(chǎng)肉類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),與傳統(tǒng)方法比較,符合率100%。LAMP方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可視,且操作簡(jiǎn)單,無(wú)需昂貴的儀器,適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。4.篩選治療鴨源沙門(mén)菌感染的中藥復(fù)方制劑的篩選研究以白頭翁為主藥復(fù)方制劑的體外抑菌效果及對(duì)人工感染沙門(mén)菌雛鴨的治療效果。體外抑菌實(shí)驗(yàn)中,復(fù)方制劑4的抑菌圈直徑最高,達(dá)到17.6mm,最低抑菌濃度為166.7mg/mL,明顯高于其它各組,說(shuō)明沙門(mén)菌對(duì)復(fù)方制劑4高度敏感;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組的治療效果最好,保護(hù)率可以達(dá)到80%,與頭孢噻呋組接近。攻毒后,血液中的紅細(xì)胞數(shù)量顯著降低、白細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P≤0.01),給予中藥治療后9～12d,紅細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)或接近正常水平,說(shuō)明以白頭翁為君藥的復(fù)方制劑4對(duì)雛鴨沙門(mén)菌病有很好的治療效果。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S858.32
【部分圖文】：

圖２部分分離菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。??Ａ．沙門(mén)菌在麥康凱上的形態(tài)Ｂ．印第安納株沙門(mén)菌在ＤＨＬ上的形態(tài)Ｃ．沙門(mén)菌在ＢＳ上的形態(tài)??Ｄ．沙門(mén)菌在ＨＥ上的形態(tài)?Ｅ．沙門(mén)菌在沙顯上的形態(tài)??Ｆｉｇ．２?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｐａｒｔ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｍｅｄｉｕｍｓ；?Ａ．?Ｃｏｌｏｎｙ?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｏｎ??ＭｃＣｏｎｋａ．?Ｂ．?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?５．?Ｉｎｄｉａｎａ?ｏｎ?ＤＨＬ．Ｃ．?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｏｎ?ＢＳ．?Ｄ．??Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｏｎ?ＨＥ．?Ｅ．?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｏｎ?ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ?ｍｅｄｉｕｍ．??

揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文：－＾．?Ｉ?－＾ｖ?４?＾?＾，?；?５１＇＾：?＾尊：錄鍵??黍礙霸｜沙門(mén)菌革蘭氏染色顯微鏡下形態(tài)??ａｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ａｆｔｅｒ?

圖３沙門(mén)菌革蘭氏染色顯微鏡下形態(tài)??Ｆｉｇ．３?Ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ａｆｔｅｒ?Ｇｒａｍ?ｓｔａｉｎｉｎＭ３??Ｉ??ｍ??
【參考文獻(xiàn)】

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