豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種影響廣泛并且危害嚴(yán)重的豬病病毒,對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)的正常生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,對(duì)于豬群中的PRRSV的感染情況的了解、發(fā)展趨勢(shì)及防控形勢(shì)等信息的掌握顯得尤為重要。本研究將2015-2017年山東省各地區(qū)收集的3526份疑似樣品使用PCR方法進(jìn)行PRRSV抗原檢測,同時(shí)對(duì)收集的12478份血清樣品使用ELISA方法進(jìn)行PRRSV抗體檢測,歸納總結(jié)該病的發(fā)生和流行趨勢(shì)。檢測結(jié)果表明,2015-2017年山東省PRRSV抗原陽性率波動(dòng)較大,PRRSV抗原陽性率分別為40.56%、46.15%、37.24%,且三年內(nèi)每季度陽性率均在33-50%之間波動(dòng);PRRSV抗體一直維持較高水平,陽性率分別為84.39%、86.38%、78.51%,說明山東省豬群的PRRSV疫苗免疫或PRRSV野毒感染十分普遍。通過對(duì)山東地區(qū)PRRSV感染情況的調(diào)查,掌握了該三年內(nèi)PRRSV的感染情況及變化趨勢(shì),顯示山東省內(nèi)的PRRS疫病感染情況平穩(wěn)的趨勢(shì),但仍存在發(fā)生疫情的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)PRRS的防控具有積極意義。在前期研究中,對(duì)PRRSV高致病性毒株感染的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)反義通路(antisense pathway)呈顯著上調(diào)活化,且其中的PSF、p54nrb、Matrin3等antisense pathway關(guān)鍵蛋白呈上調(diào)表達(dá)。為了探索PSF和p54nrb蛋白對(duì)PRRSV在MARC-145細(xì)胞的增殖的影響,本研究通過設(shè)計(jì)PSF、p54nrb和PRRSV N基因的引物,建立熒光定量PCR檢測方法,驗(yàn)證了對(duì)以上基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析方法的可靠性。通過熒光定量方法可以極大增加檢測PSF、p54nrb和PRRSV N基因的準(zhǔn)確性和敏感性,提高了PSF、p54nrb和PRRSV N基因的檢測水平。為了進(jìn)一步了解PSF、p54nrb在PRRSV增殖過程中的作用和影響,首先采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)和重組慢病毒技術(shù)上調(diào)了MARC-145細(xì)胞中PSF和p54nrb蛋白表達(dá)水平,進(jìn)而分別檢測在上述條件下PRRSV的增殖情況。試驗(yàn)結(jié)果表明,MARC-145細(xì)胞中PSF和p54nrb蛋白的下調(diào),抑制了PRRSV的增殖,且在以上兩種蛋白同時(shí)下調(diào)表達(dá)時(shí)增殖作用更加明顯;在上調(diào)PSF和p54nrb蛋白的各組中,PRRSV的增殖明顯高于對(duì)照組,且共同上調(diào)PSF和p54nrb蛋白對(duì)于PRRSV的增加明顯。綜合分析PSF和p54nrb蛋白的表達(dá)對(duì)PRRSV的增殖作用的結(jié)果,可以說明PSF和p54nrb蛋白的表達(dá)有助于PRRSV的增殖,并且在PSF和p54nrb的協(xié)同作用下,對(duì)PRRSV的增殖作用更加明顯。因此,PSF和p54nrb蛋白在PRRSV增殖過程中起到了促進(jìn)作用,對(duì)PSF和p54nrb蛋白的功能研究具有積極意義,對(duì)PRRSV的深入研究以及防控提供了參考。
【學(xué)位單位】：聊城大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

圖 1 PRRSV SX-1 株（強(qiáng)毒力）感染的 Marc-145 細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。上調(diào)蛋白以紅色顯示，下調(diào)蛋白以藍(lán)色顯示。圓圈大小表示蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)相互作用的能力，用度數(shù)表示。蛋白質(zhì)的作用程度越大，蛋白質(zhì)與之相互作用的程度就越大。SFPQ和 NONO分別是 PSF和 p54nrb的同義詞。來自 Chen Z、Liu S、Zhang S 等的數(shù)據(jù)。Fig.1 Signal networks of differentially expressed proteins of MARC-145 cells infected by PRRSV SX-1strain (highly virulent). Upregulated proteins are shown in red, whereas downregulated proteins areshown in blue. Circle sizes represent the capacity of a protein to interact with other proteins, which isquantified in degrees. The greater degree a protein has, the more altered proteins interact with it. SFPQand NONO are the synonyms of PSF and p54nrb, respectively.. Data from Chen Z, Liu S, Zhang S, et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains with higher virulence cause marked proteinprofile changes in MARC-145 cells[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 15000.

標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 3-2） PSF 蛋白基因標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.6175，軸距為 4方程為 y=-3.6175x+36.87，敏感性為 102，相關(guān)系數(shù)為 0.999 圖 3-1 PSF 熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線（copies/μL）Fig. 3-1 Dynamic curve of fluorescence quantitative PCR for PSF

聊城大學(xué)碩士學(xué)位論文 PSF 蛋白基因熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立過摸索后，使用 20 μL 熒光定量 PCR 體系：使用 SYBR Premix Ex TaqL；PCR Forward Primer (10μM)為 0.4 μM；PCR Reverse Primer (10μM板為 2.0 μL；RNase Free dH2O 為 7.2 μL 將體系混合均勻后，進(jìn)行熒應(yīng)條件為：94 ℃，2 min，1 cycle；擴(kuò)增階段：94 ℃, 5 s； 60 ℃, 15 s，5 cycle 從熒光定量 PCR 結(jié)果可以得到 PSF 蛋白基因的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 3-2） PSF 蛋白基因標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.6175，軸距為 4線方程為 y=-3.6175x+36.87，敏感性為 102，相關(guān)系數(shù)為 0.999
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2861937