奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中一種常見的疾病又稱奶牛乳房炎。物理、化學(xué)、病原微生物等因素都可以導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生,其中病原微生物乳腺內(nèi)感染是發(fā)病最主要的原因。在治療乳腺炎的過程中,人們通常專注于使用抗生素來殺滅病原微生物,往往忽略了抑制炎癥反應(yīng)的重要性。過度的炎癥反應(yīng)是造成乳腺組織損傷的重要原因。已有研究表明抗生素和抗炎藥物的聯(lián)合使用可有效的殺滅病原微生物、控制炎癥反應(yīng),并極大縮短了治療周期。因此,在乳腺炎治療藥物的研究工作中我們不但要重視新型抗生素的開發(fā),同時(shí)對(duì)新型、有效抗炎藥物的尋找也至關(guān)重要。楊梅素又稱楊梅樹皮素、楊梅黃酮,是從楊梅科植物楊梅的樹皮中提取的一種黃酮醇類化合物。已有研究發(fā)現(xiàn)楊梅素具有抗炎作用,但是其在乳腺炎中是否發(fā)揮抗炎功能,還尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)建立了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型和乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,系統(tǒng)的研究了楊梅素對(duì)LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型的影響及其機(jī)制。首先我們研究了楊梅素對(duì)LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎的影響。我們利用乳腺內(nèi)灌注LPS成功構(gòu)建了小鼠乳腺炎模型,并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射楊梅素。在乳導(dǎo)管內(nèi)注射LPS 24 h后收集乳腺組織樣品,一部分乳腺固定、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin,HE)染色,利用顯微鏡觀察乳腺組織的損傷情況以及炎性細(xì)胞在乳腺腺泡內(nèi)的浸潤(rùn)情況;一部分乳腺組織研磨后,利用髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MPO活性,利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒檢測(cè)炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。結(jié)果顯示楊梅素可以顯著緩解LPS對(duì)乳腺組織造成的損傷,降低MPO活性和促炎細(xì)胞因子濃度。然后,我們應(yīng)用LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞(Mouse mammary epithelial cells,mMECs)炎癥反應(yīng)模型,研究了楊梅素對(duì)體外mMECs炎癥反應(yīng)的影響,從而進(jìn)一步驗(yàn)證楊梅素對(duì)乳腺炎的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊梅素在mMECs中能顯著降低LPS-誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6基因水平同時(shí)降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白水平。這些結(jié)果說明楊梅素在LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型具有抗炎作用。為了明確楊梅素在LPS-誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠模型中潛在的抗炎機(jī)制,我們?cè)贚PS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型以及mMECs炎癥反應(yīng)模型中檢測(cè)了楊梅素對(duì)炎癥關(guān)鍵炎癥信號(hào)分子活化程度的影響。乳腺組織及mMEC的Western blot結(jié)果都顯示楊梅素可以抑制AKT/IKK/NF-κB信號(hào)通路和P38、ERK的磷酸化水平。這些結(jié)果說明楊梅素通過抑制AKT/IKK/NF-κB信號(hào)通路和P38、ERK蛋白的磷酸化水平減少促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制乳腺組織的炎癥反應(yīng)。血-乳屏障的完整性在乳腺炎發(fā)生時(shí)遭到破壞,修復(fù)血-乳屏障能改善乳腺組織的炎癥狀態(tài)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)楊梅素在LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中,通過增加緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-3蛋白表達(dá)來修復(fù)血-乳屏障的完整性。這些結(jié)果說明楊梅素也能通過維持血-乳屏障的完整性緩解乳腺組織炎癥水平。綜上所述,楊梅素在LPS-誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中能抑制乳腺組織炎癥反應(yīng)。其機(jī)制一方面是通過抑制AKT/IKK/NF-κB信號(hào)通路及P38和ERK信號(hào)通路;另一方面是通過保護(hù)血-乳屏障的完整性。因此,楊梅素有潛力成為乳腺炎治療的有效抗炎藥物。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 1.1 楊梅素在 LPS 誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中對(duì)乳腺組織病理學(xué)損傷的影響。Fig. 1.1 Effect of myricetin on mammary histopathological changes in mammarygland of LPS-induced mice mastitis.

MPO 活性和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。我們利用 MPO 方法檢測(cè)組織中 MPO 水平，ELISA 方法檢測(cè)乳腺組織中的炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白的分泌情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS顯著促使MPO活性（圖1.2 A）和促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平（圖 1.2 B、C、D）的升高。楊梅素預(yù)處理后可以顯著減少乳腺組織中 MPO 水平的升高，顯著降低炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白水平的升高。
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本文編號(hào)：2861631