嘔吐毒素(deoxynivalenol,DON)是由雪腐鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌所產(chǎn)生的一類毒素,廣泛存在于小麥、玉米等飼料原料及成品飼料中,是檢出率和超標(biāo)率最高的一種真菌毒素,對動物和人的危害巨大。微生物發(fā)酵處理作為一種安全環(huán)保的處理方式,成為研究嘔吐毒素降解的熱點(diǎn)。本研究旨在篩選出對嘔吐毒素降解能力高的微生物菌株,對其進(jìn)行鑒定培養(yǎng)并應(yīng)用于飼料原料的生物脫毒處理中。試驗(yàn)從不同環(huán)境中采集土壤、淤泥、發(fā)霉秸稈、雞腸道內(nèi)容物、豬糞、牛糞等樣品共10份。將DON添加到LB,NA和MRS固體培養(yǎng)基中以制備用于初始篩選菌株的改良的固體篩選培養(yǎng)基。通過初步篩選獲得到的菌株在改良液體培養(yǎng)基培養(yǎng),并且通過ELISA測量改良培養(yǎng)基中DON的降解率對菌種進(jìn)行復(fù)篩,根據(jù)培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式和降解率,選擇部分分解菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、顯微鏡鏡檢和16Sr DNA保守序列分析,確定其種屬。組合所篩選和鑒定的菌種,優(yōu)化出發(fā)酵條件,對麩皮和豆粕中的天然DON進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明:通過初篩篩選到80株能夠在初篩培養(yǎng)基生長的菌種,經(jīng)過復(fù)篩篩選到DON降解率從9.7%~66.7%的菌種16株。選擇降解率分別為19.1%、51.3%、66.7%的菌種3株,通過菌落特征、菌體特征等形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA保守序列比對的分子鑒定。其中,LB01菌株為乳白色,不透明,表面粗糙,邊緣不規(guī)則,干燥,有褶皺,菌體呈長桿狀,有莢膜,有芽孢,與GeneBank中EnB-alf13(KP792638.1)的相似度達(dá)到92%的降解菌為枯草芽孢桿菌;菌株NA06的菌落為乳白色,表面干燥且不透明,中間褶皺邊緣不整齊,菌體兩端鈍圓,呈長桿狀,沒有伴孢晶體,成對或鏈排列,孢囊沒有明顯的腫脹,與GeneBank中MSC46(KM222187.1)的相似度達(dá)到99%的降解菌為解淀粉芽孢桿菌;菌株MRS13為乳白色半透明,直徑在0.4~2.0 mm,邊緣整齊,凸起、光滑且表面濕潤,菌體呈短桿狀,且其菌體的排列方式有單個和鏈狀排列,無芽孢,與GeneBank中Sourdough-H04(MG754699.1)的相似度達(dá)到99%的降解菌為植物乳桿菌。通過單因素試驗(yàn)確定降解麩皮中DON的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為:接種量10 mL/100g,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時(shí)間48 h。通過不同發(fā)酵底物對比試驗(yàn),發(fā)酵麩皮時(shí),枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌組合對麩皮中嘔吐毒素降解率最高,達(dá)71%。相同發(fā)酵條件下,解淀粉芽孢桿菌對豆粕中嘔吐毒素降解率最高,達(dá)82%。
【學(xué)位單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S816.3
【部分圖文】：

(vomitoxin)學(xué)名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DFusarium nigrum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、禾m graminearum）黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）等鐮刀菌在結(jié)構(gòu)上是 B 型單端孢霉烯族化合物，廣泛存在于被污染[1-3]。DON 第一次被發(fā)現(xiàn)是從感染了赤霉病的谷物中由諸罔道。DON 首次被分離到是在 1972 年，日本的 Morooka 等大麥中分離得到，1973 年，Yoshizawa 等從受污染的玉米中其分子結(jié)構(gòu)是雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)的 4-脫氧衍生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(4-deoxynivalenol,DON)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)和拒食，所以將其定名為嘔吐毒素(Vomitoxin，VT)。徐一純等赤霉病的大麥中也分離得到一種新的導(dǎo)致拒食和嘔吐的毒素2[5]。嘔吐毒素的分子式為 C15H2006，嘔吐毒素的化學(xué)名為 15-三羥基單端孢霉烯-9-烯-8-酮，相對分子質(zhì)量為量 296.32，1-1 所示。

圖 1-2 DON 的 3 個降解靶位Fig. 1-2 3 degradation targets of DON目前研究發(fā)現(xiàn)的能夠降解嘔吐毒素的微生物有釀酒酵母（Saccharomycesrevisiae ）、 紅 酵 母 （ Rhodotorula rubra ）、 農(nóng) 桿 菌 根 瘤 菌Agrobacterium-Rhizobium）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii ssp）、馬克斯魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、發(fā)酵型腸桿菌（Fermented Enterobacter）桿菌 BBSH797 等。研究者們從多種不同的樣品中篩到了不同的降解菌，有魚臟內(nèi)容物、土壤、牛瘤胃液以及雞腸道內(nèi)容物等[6,48]。這些微生物或其產(chǎn)生的解酶可將嘔吐毒素轉(zhuǎn)化為其他低毒的代謝物，甚至可以在以 DON 為唯一碳源培養(yǎng)基上生長。V lkl 等研究推測嘔吐毒素分子的 C3-OH 氧化成 3-酮基是輔 NADPH 或 NADH 與乙醇脫氫酶結(jié)合作用的結(jié)果[49]。Shima 等篩選得到一株土桿菌屬根瘤菌 E3-39，可將 DON 代謝為 3-keto-DON。后續(xù)研究推測這種轉(zhuǎn)化 E3-39 菌分泌的胞外酶作用的結(jié)果[50]。Fuchs 等研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)桿菌屬細(xì)菌BSH797 可將 DON 轉(zhuǎn)化為唯一產(chǎn)物 DOM-1[51]

B0—0(μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值b.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為試劑盒中 5 個標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)，縱坐標(biāo)為 5 個平均百分吸光度值。將檢測樣品的百分吸光度值代入到所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線中樣本處理時(shí)所稀釋得倍數(shù)就能算出樣品中 DON 的實(shí)際含量。3. DON 降解率計(jì)算公式為：降解率=（空白組 DON 含量－樣本組 DO白組 DON 含量×100%。.3 試驗(yàn)結(jié)果.3.1 菌株的篩選在 LB、NA 和 MRS 中添加 DON，配制成改良固體培養(yǎng)基，采用平板線方法，以好氧和厭氧 2 種方式共得到在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)不同的單，其中從 LB 培養(yǎng)基中得到 30 株，NA 培養(yǎng)基 23 株，MRS 培養(yǎng)基 27 株篩結(jié)果如圖 2-1 所示：
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2857979