豬δ冠狀病毒(PDCoV)是近年發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道冠狀病毒,主要引起仔豬腹瀉和腸道損傷。PDCoV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目,冠狀病毒科,δ冠狀病毒屬成員。全長基因組約25.4 kb,其基因組序列為5?UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3?UTR,編碼15個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp2-nsp16),4個結(jié)構(gòu)蛋白和3個特異性輔助蛋白。研究證實感染脊椎動物的套式病毒目病毒(冠狀病毒科和動脈炎病毒科)編碼的內(nèi)切核糖核酸酶(又稱為NendoU)較為保守,在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用,并且已證實部分冠狀病毒的內(nèi)切核糖核酸酶(nsp15)和動脈炎病毒的同源蛋白nsp11能夠拮抗干擾素(IFN)的產(chǎn)生。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)PDCoV通過抑制RIG-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗IFN-β的產(chǎn)生,而PDCoV nsp15是否參與拮抗IFN-β的產(chǎn)生尚不清楚�；诖�,本課題以PDCoV nsp15作為研究對象,探究其對IFN-β產(chǎn)生的影響以及具體的作用機制。主要研究內(nèi)容如下:1.PDCoV nsp15呈劑量依賴性抑制IFN-β的產(chǎn)生將不同劑量的PDCoV nsp15真核表達質(zhì)粒與IFN-β熒光素酶報告質(zhì)粒IFN-β–Luc、內(nèi)參質(zhì)粒pTK-Luc分別共轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析和RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)PDCoV nsp15顯著抑制仙臺病毒(SeV)誘導(dǎo)的IFN-β啟動子激活以及IFN-βmRNA表達,并且呈劑量依賴性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β產(chǎn)生的特性。2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化IRF3和NF-κB是調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,為了探究PDCoV nsp15是否影響它們的活化從而拮抗IFN-β的產(chǎn)生,將nsp15的真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)nsp15顯著抑制SeV誘導(dǎo)的NF-κB活化并呈劑量依賴性,但對SeV誘導(dǎo)的IRF3的活化無顯著影響;IRF3和p65的磷酸化及其核轉(zhuǎn)運分別是IRF3和NF-κB激活的標志,Western blot和間接免疫熒光(IFA)試驗結(jié)果表明nsp15蛋白主要抑制SeV誘導(dǎo)的p65磷酸化和入核,不影響IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通過抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的產(chǎn)生。3.PDCoV nsp15的關(guān)鍵酶活位點為His219、His234和Lys269根據(jù)PDCoV和其他冠狀病毒nsp15的氨基酸序列同源性比對及結(jié)構(gòu)同源性分析,推測PDCoV的NendoU結(jié)構(gòu)域活性催化氨基酸位點為His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通過定點突變的方法獲得3個突變的nsp15基因,并將其和野生型nsp15基因分別克隆至原核表達載體中,獲得重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-nsp15以及相應(yīng)的突變體質(zhì)粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、純化后,利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移試驗(FRET)分析發(fā)現(xiàn),與nsp15野生型蛋白相比,3個突變體蛋白的NendoU活性顯著降低,說明His129、His234和Lys269是PDCoV nsp15的關(guān)鍵酶活位點。4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的產(chǎn)生不依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性有報道某些冠狀病毒nsp15和動脈炎病毒nsp11拮抗I型IFN的產(chǎn)生依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性;也有研究表明動脈炎病毒nsp11潛在的細胞毒性會影響IFN的產(chǎn)生。為了探討PDCoV nsp15對IFN-β產(chǎn)生的抑制作用是否依賴于其內(nèi)切核糖核酸酶活性及細胞毒性,首先檢測了PDCoV nsp15野生型和突變體的細胞毒性,發(fā)現(xiàn)野生型對細胞有一定的毒性作用,3種突變體對細胞幾乎沒有毒性。在此基礎(chǔ)上,將表達PDCoV nsp15野生型及突變體(H219A、H234A和K269A)的真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn),3個突變體與野生型一樣均顯著抑制SeV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生,相互之間無顯著差異;且主要抑制p65的磷酸化,而對IRF3的磷酸化無顯著影響。進一步以突變體H234A為代表,檢測了nsp15突變體對內(nèi)源性IRF3和p65核轉(zhuǎn)運的影響,結(jié)果與nsp15野生型一樣,突變體H234A抑制了SeV誘導(dǎo)的p65入核,但不影響IRF3的入核。上述結(jié)果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的產(chǎn)生和NF-κB的活化不依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性,也不是其細胞毒性所致。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

激活了RLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo) I型IFN的產(chǎn)生和抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在宿主細胞拮抗冠狀病毒的感染中發(fā)揮重要作用守的 DExD/H 結(jié)構(gòu)的 RNA 依賴的 ATP 水解酶（ATPase）IG-I（Retinoic acid-inducible gene I）、MDA5（melanomaGP2（laboratory of genetics and physiology 2）三個成員， RNA 病毒(Yoneyama et al 2005)。當病毒 RNA 被 RIG-I/MAVS 依賴的抗病毒信號傳遞，活化的 RIG-I/MDA5 與 R蛋白 MAVS 相互作用(Seth et al 2005)，使 MAVS 活化聚形成 MAVS 信號小體，隨后分成兩條信號傳遞，一方面AF-2/6 與腫瘤壞死因子受體相互作用，激活 IKK -IKKβ-IK因子 κB（NF-κB）活化(Takaoka et al 2005, Vallabhapurapu 一方面通過 TRAF3 將下游的 TBK1 和 IKK 激活，協(xié)助 的磷酸化以及二聚體形成(Paz et al 2011)�；罨� IRF3/I轉(zhuǎn)錄共激活因子 CBP（CREB binding protein）/p300 結(jié)FN-β 轉(zhuǎn)錄，建立細胞的抗病毒狀態(tài)(Yoneyama et al 1998)（

第 4 章 結(jié)果與分析4.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 誘導(dǎo)的 IFN-β 產(chǎn)生為了探究 PDCoV nsp15 對 I 型 IFN 產(chǎn)生的影響，將不同劑量的 PDCoV nsp15真核表達質(zhì)粒 pCAGGS-HA-nsp15 與熒光素酶報告質(zhì)粒 IFN-β-Luc 和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 共轉(zhuǎn)染 24 孔細胞培養(yǎng)板長滿單層的 LLC-PK1/HEK-293T 細胞，并設(shè)立相應(yīng)的空載體 pCAGGS-HA 作為陰性對照，24 h 后感染 SeV，12 h 后收樣，檢測雙熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SeV 顯著誘導(dǎo)了 IFN-β 啟動子激活，而 PDCoV nsp15 呈劑量依賴性抑制 SeV 誘導(dǎo)的 IFN-β 啟動子激活（圖 4-1A 和 4-1C）。進一步將pCAGGS-HA-nsp15 轉(zhuǎn)染 LLC-PK1/HEK-293T 細胞上，24 h 后感染 SeV，12 h 后收樣，提取細胞總 RNA，通過熒光定量 RT-PCR 檢測 IFN-β mRNA 水平的表達，結(jié)果顯示，PDCoV nsp15 能在 mRNA 水平上顯著抑制 SeV 誘導(dǎo)的 IFN-β 產(chǎn)生（圖 4-1B和 4-1D）。這些結(jié)果表明 PDCoV nsp15 顯著抑制 SeV 誘導(dǎo)的 IFN-β 產(chǎn)生，并呈劑量依賴性。

豬 冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp15 抑制 IFN-β 產(chǎn)生的機制研究4.2 PDCoV nsp15 主要抑制 NF-κB 的活化4.2.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 誘導(dǎo)的 NF-κB 激活I(lǐng)RF3 和 NF-κB 是 I 型干擾素信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，因此我們進一步探究PDCoV nsp15 對 SeV 誘導(dǎo)的 IRF3 和 NF-κB 活化的影響。將不同劑量的pCAGGS-HA-nsp15 真核表達質(zhì)粒與報告質(zhì)粒 pRL-TK、IRF3-Luc 或 NF-κB-Luc 共轉(zhuǎn)染 LLC-PK1/HEK-293T 細胞，24 h 后感染 SeV，12 h 收取樣品進行雙熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示 PDCoV nsp15 顯著抑制 SeV 誘導(dǎo)的 NF-κB 激活，呈劑量依賴性（圖 4-2C 和 4-2D）；但對 SeV 誘導(dǎo)的 IRF3 激活無顯著影響（圖 4-2A 和 4-2B）。
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本文編號：2857660