【摘要】：結(jié)核病是一種全球性的、人畜共患傳染病,是嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的重大疫病之一。由于沒有有效的預防和根除方法,目前主要采用檢疫-撲殺結(jié)合的方法。結(jié)核病的發(fā)生與機體的抗病力密切相關(guān),因而,如何提高機體的抗結(jié)核能力一直是人們關(guān)注的焦點。近年來,病原-宿主相關(guān)作用機制研究的深入、基因編輯技術(shù)和動物克隆技術(shù)的快速發(fā)展,使抗結(jié)核牛羊的培育和生產(chǎn)成為可能。研究顯示,機體對結(jié)核分支桿菌的抵抗力強弱與天然免疫力相關(guān)巨噬細胞蛋白1(Nramp1)的表達存在量依賴性關(guān)系。因此通過轉(zhuǎn)基因手段來增強牛Nramp1基因表達,培育抗病種群,可成為控制牛結(jié)核病的一個新切入點。本研究分別克隆了秦川牛Nramp1開放閱讀框及荷斯坦奶牛Nramp1基因啟動子區(qū)(5’側(cè)翼區(qū)-1483~+73)序列,構(gòu)建了牛Nramp1吞噬細胞特異性真核表達載體,轉(zhuǎn)染荷斯坦奶牛新生牛成纖維細胞,篩選陽性克隆作為核移植供體細胞,生產(chǎn)培育轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛,取得以下結(jié)果:1.基因克隆、載體構(gòu)建與功能驗證。以秦川牛外周血總RNA為模板PCR擴增Nramp1基因開放閱讀框,獲得的序列對比Gen Bank中的牛的相應的基因序列(Gen Bank序列號U12862.1),發(fā)現(xiàn)存在2個堿基差異:第1個差異堿基致使基因編碼的第49個氨基酸發(fā)生變化使蘇氨酸(ACA)轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?GCA);第2個差異堿基并未引起其編碼氨基酸的差異,即第53位氨基酸均為精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’側(cè)翼區(qū)(-1483~+73)序列在巨噬細胞內(nèi)有啟動子活性,且H37Ra可以誘導調(diào)節(jié)該區(qū)段的啟動子活性。使用牛Nramp1基因5’側(cè)翼區(qū)(-1483~+73)序列調(diào)控Nramp1基因表達,構(gòu)建了牛Nramp1吞噬細胞特異性表達載體p Lox P-2A-N。載體p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽連接GFP與Neo基因,并在細胞篩選標記基因兩側(cè)添加同向的Lox P位點。將該片段分別轉(zhuǎn)入E.coli BM25.8菌株和HEK293,經(jīng)菌體Cre酶及Cre酶細胞共孵育實驗均證明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中間的篩選標記基因,但序列中會殘存一個Lox P位點。2.轉(zhuǎn)基因細胞株的篩選與鑒定。線性化載體p Lox P-2A-N轉(zhuǎn)染奶牛成纖維細胞獲得轉(zhuǎn)Nramp1基因細胞株D4、E3。Q-PCR鑒定2株細胞外源基因拷貝數(shù)為1。染色體步移試驗檢測出D4株外源基因插入第29號染色體、E3外源基因插入第10號染色體,兩細胞株外源基因插入位點均位于基因組非編碼區(qū)內(nèi)。細胞核型試驗證明2株細胞染色體數(shù)目均為60條。3.核移植與轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)、鑒定。以D4、E3作為核移植供體細胞生產(chǎn)的轉(zhuǎn)Nramp1基因重構(gòu)胚胎體外及體內(nèi)發(fā)育率正常,獲得3頭犢牛(大于2月齡)經(jīng)PCR與Soutern Blot鑒定均為轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入沒有影響其插入位點上下游基因m RNA的表達水平。分離轉(zhuǎn)基因牛與非轉(zhuǎn)基因牛(供體細胞來源)外周血單核細胞誘導為巨噬細胞。結(jié)核分支桿菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因牛MDMs Nramp1基因表達量與非轉(zhuǎn)基因牛差異不顯著;攻菌后,轉(zhuǎn)基因牛MDMs Nramp1基因表達量顯著高于非轉(zhuǎn)基因牛。攻菌3 d后,轉(zhuǎn)基因牛MDMs細胞荷菌數(shù)顯著低于非轉(zhuǎn)基因牛。說明秦川牛Nramp1基因的轉(zhuǎn)入增強了荷斯坦奶牛MDMs對結(jié)分支核菌的抑制與殺傷作用,即轉(zhuǎn)入Nramp1增強了牛對結(jié)核分支桿菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期發(fā)育階段體外培養(yǎng)體系的確立。通過SCNT檢測胚胎發(fā)育率、囊胚細胞總數(shù)、ROS水平、囊胚細胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎體外培養(yǎng)全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎質(zhì)量與發(fā)育能力。在轉(zhuǎn)基因牛培育過程中不適宜使用Vit-C作為添加劑。綜上所述,本研究獲得3頭轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛,完善了轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)技術(shù)體系。從增強動物體自身天然免疫力角度出發(fā),通過轉(zhuǎn)基因手段培育抗病種群,為牛結(jié)核病的防控創(chuàng)造一個新切入點。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S858.23
【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻綜述
    第一章 影響機體抵抗分支桿菌感染的遺傳因素
        1.1 天然免疫力相關(guān)巨噬細胞蛋白 1
        1.2 細胞內(nèi)病原抗性基因 1
        1.3 γ-干擾素受體及信號通路
        1.4 維生素D及其受體
        1.5 人類白細胞抗原
        1.6 巨噬細胞移動抑制因子
        1.7 全基因組關(guān)聯(lián)研究
        1.8 展望
    第二章 Nramp1 研究進展
        2.1 Nramp基因家族
        2.2 Nramp1 基因抗結(jié)核研究
            2.2.1 機體免疫力與結(jié)核分支桿菌的相互作用
            2.2.2 Nramp1 基因多態(tài)性研究
            2.2.3 缺氧誘導因子 1α 與Nramp1
        2.3 Nramp1 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控
            2.3.1 Nramp1 近端啟動子
            2.3.2 組蛋白修飾模式
            2.3.3 Nramp1 表達調(diào)控元件
        2.4 本研究的內(nèi)容及意義
試驗研究
    第三章 Nramp1 細胞特異性表達載體構(gòu)建及啟動子活性分析
        3.1 材料
            3.1.1 實驗動物和組織細胞
            3.1.2 菌株和質(zhì)粒
            3.1.3 主要試劑
            3.1.4 測試化驗加工
            3.1.5 引物設計
        3.2 方法
            3.2.1 篩選報告基因序列擴增及功能檢測
            3.2.2 載體pLoxP-2A-A的構(gòu)建
            3.2.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因啟動子區(qū)擴增及活性檢測
            3.2.4 Nramp1 細胞特異性表達載體pLoxP-2A-N載體構(gòu)建及其功能驗證
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 篩選報告基因序列擴增及功能檢測
            3.3.2 載體pLoxP-2A-A的構(gòu)建
            3.3.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因啟動子區(qū)擴增及活性檢測
            3.3.4 Nramp1 細胞特異性表達載體pLoxP-2A-N構(gòu)建及其功能驗證
        3.4 討論
        3.5 結(jié)論
    第四章 轉(zhuǎn)牛Nramp1 基因成纖維細胞株篩選及鑒定
        4.1 材料
            4.1.1 實驗動物和組織細胞
            4.1.2 菌株和質(zhì)粒
            4.1.3 主要試劑
            4.1.4 引物設計
        4.2 方法
            4.2.1 新生荷斯坦奶牛成纖維細胞的分離培養(yǎng)
            4.2.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細胞篩選
            4.2.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細胞株鑒定
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 新生荷斯坦奶牛成纖維細胞的分離培養(yǎng)
            4.3.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細胞篩選
            4.3.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細胞鑒定
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 轉(zhuǎn)Nramp1 基因牛的生產(chǎn)與鑒定
        5.1 材料
            5.1.1 實驗動物和組織細胞
            5.1.2 菌株和質(zhì)粒
            5.1.3 主要試劑
            5.1.4 引物設計
        5.2 方法
            5.2.1 SCNT胚胎體外培養(yǎng)條件優(yōu)化
            5.2.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因重構(gòu)胚的培養(yǎng)
            5.2.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因牛生產(chǎn)及鑒定
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 培養(yǎng)液添加Vit-C對牛SCNT胚胎發(fā)育的影響
            5.3.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因克隆胚的制備
            5.3.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因克隆牛的生產(chǎn)
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新之處與進一步研究的課題
參考文獻
附錄
縮略 詞
致謝
作者簡介

【參考文獻】

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1 程祥;牛Nramp1基因的分子克隆及其功能驗證[D];西北農(nóng)林科技大學;2012年

本文編號：2857613