【摘要】：結(jié)核病是一種全球性的、人畜共患傳染病,是嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的重大疫病之一。由于沒(méi)有有效的預(yù)防和根除方法,目前主要采用檢疫-撲殺結(jié)合的方法。結(jié)核病的發(fā)生與機(jī)體的抗病力密切相關(guān),因而,如何提高機(jī)體的抗結(jié)核能力一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái),病原-宿主相關(guān)作用機(jī)制研究的深入、基因編輯技術(shù)和動(dòng)物克隆技術(shù)的快速發(fā)展,使抗結(jié)核牛羊的培育和生產(chǎn)成為可能。研究顯示,機(jī)體對(duì)結(jié)核分支桿菌的抵抗力強(qiáng)弱與天然免疫力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1(Nramp1)的表達(dá)存在量依賴性關(guān)系。因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)增強(qiáng)牛Nramp1基因表達(dá),培育抗病種群,可成為控制牛結(jié)核病的一個(gè)新切入點(diǎn)。本研究分別克隆了秦川牛Nramp1開(kāi)放閱讀框及荷斯坦奶牛Nramp1基因啟動(dòng)子區(qū)(5’側(cè)翼區(qū)-1483~+73)序列,構(gòu)建了牛Nramp1吞噬細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染荷斯坦奶牛新生牛成纖維細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆作為核移植供體細(xì)胞,生產(chǎn)培育轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛,取得以下結(jié)果:1.基因克隆、載體構(gòu)建與功能驗(yàn)證。以秦川牛外周血總RNA為模板PCR擴(kuò)增Nramp1基因開(kāi)放閱讀框,獲得的序列對(duì)比Gen Bank中的牛的相應(yīng)的基因序列(Gen Bank序列號(hào)U12862.1),發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)堿基差異:第1個(gè)差異堿基致使基因編碼的第49個(gè)氨基酸發(fā)生變化使蘇氨酸(ACA)轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?GCA);第2個(gè)差異堿基并未引起其編碼氨基酸的差異,即第53位氨基酸均為精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’側(cè)翼區(qū)(-1483~+73)序列在巨噬細(xì)胞內(nèi)有啟動(dòng)子活性,且H37Ra可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)該區(qū)段的啟動(dòng)子活性。使用牛Nramp1基因5’側(cè)翼區(qū)(-1483~+73)序列調(diào)控Nramp1基因表達(dá),構(gòu)建了牛Nramp1吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體p Lox P-2A-N。載體p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽連接GFP與Neo基因,并在細(xì)胞篩選標(biāo)記基因兩側(cè)添加同向的Lox P位點(diǎn)。將該片段分別轉(zhuǎn)入E.coli BM25.8菌株和HEK293,經(jīng)菌體Cre酶及Cre酶細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)均證明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中間的篩選標(biāo)記基因,但序列中會(huì)殘存一個(gè)Lox P位點(diǎn)。2.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的篩選與鑒定。線性化載體p Lox P-2A-N轉(zhuǎn)染奶牛成纖維細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)Nramp1基因細(xì)胞株D4、E3。Q-PCR鑒定2株細(xì)胞外源基因拷貝數(shù)為1。染色體步移試驗(yàn)檢測(cè)出D4株外源基因插入第29號(hào)染色體、E3外源基因插入第10號(hào)染色體,兩細(xì)胞株外源基因插入位點(diǎn)均位于基因組非編碼區(qū)內(nèi)。細(xì)胞核型試驗(yàn)證明2株細(xì)胞染色體數(shù)目均為60條。3.核移植與轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)、鑒定。以D4、E3作為核移植供體細(xì)胞生產(chǎn)的轉(zhuǎn)Nramp1基因重構(gòu)胚胎體外及體內(nèi)發(fā)育率正常,獲得3頭犢牛(大于2月齡)經(jīng)PCR與Soutern Blot鑒定均為轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入沒(méi)有影響其插入位點(diǎn)上下游基因m RNA的表達(dá)水平。分離轉(zhuǎn)基因牛與非轉(zhuǎn)基因牛(供體細(xì)胞來(lái)源)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。結(jié)核分支桿菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因牛MDMs Nramp1基因表達(dá)量與非轉(zhuǎn)基因牛差異不顯著;攻菌后,轉(zhuǎn)基因牛MDMs Nramp1基因表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因牛。攻菌3 d后,轉(zhuǎn)基因牛MDMs細(xì)胞荷菌數(shù)顯著低于非轉(zhuǎn)基因牛。說(shuō)明秦川牛Nramp1基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了荷斯坦奶牛MDMs對(duì)結(jié)分支核菌的抑制與殺傷作用,即轉(zhuǎn)入Nramp1增強(qiáng)了牛對(duì)結(jié)核分支桿菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期發(fā)育階段體外培養(yǎng)體系的確立。通過(guò)SCNT檢測(cè)胚胎發(fā)育率、囊胚細(xì)胞總數(shù)、ROS水平、囊胚細(xì)胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎體外培養(yǎng)全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎質(zhì)量與發(fā)育能力。在轉(zhuǎn)基因牛培育過(guò)程中不適宜使用Vit-C作為添加劑。綜上所述,本研究獲得3頭轉(zhuǎn)Nramp1基因克隆牛,完善了轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)技術(shù)體系。從增強(qiáng)動(dòng)物體自身天然免疫力角度出發(fā),通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段培育抗病種群,為牛結(jié)核病的防控創(chuàng)造一個(gè)新切入點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;S858.23
【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻(xiàn)綜述
    第一章 影響機(jī)體抵抗分支桿菌感染的遺傳因素
        1.1 天然免疫力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白 1
        1.2 細(xì)胞內(nèi)病原抗性基因 1
        1.3 γ-干擾素受體及信號(hào)通路
        1.4 維生素D及其受體
        1.5 人類白細(xì)胞抗原
        1.6 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子
        1.7 全基因組關(guān)聯(lián)研究
        1.8 展望
    第二章 Nramp1 研究進(jìn)展
        2.1 Nramp基因家族
        2.2 Nramp1 基因抗結(jié)核研究
            2.2.1 機(jī)體免疫力與結(jié)核分支桿菌的相互作用
            2.2.2 Nramp1 基因多態(tài)性研究
            2.2.3 缺氧誘導(dǎo)因子 1α 與Nramp1
        2.3 Nramp1 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控
            2.3.1 Nramp1 近端啟動(dòng)子
            2.3.2 組蛋白修飾模式
            2.3.3 Nramp1 表達(dá)調(diào)控元件
        2.4 本研究的內(nèi)容及意義
試驗(yàn)研究
    第三章 Nramp1 細(xì)胞特異性表達(dá)載體構(gòu)建及啟動(dòng)子活性分析
        3.1 材料
            3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織細(xì)胞
            3.1.2 菌株和質(zhì)粒
            3.1.3 主要試劑
            3.1.4 測(cè)試化驗(yàn)加工
            3.1.5 引物設(shè)計(jì)
        3.2 方法
            3.2.1 篩選報(bào)告基因序列擴(kuò)增及功能檢測(cè)
            3.2.2 載體pLoxP-2A-A的構(gòu)建
            3.2.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增及活性檢測(cè)
            3.2.4 Nramp1 細(xì)胞特異性表達(dá)載體pLoxP-2A-N載體構(gòu)建及其功能驗(yàn)證
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 篩選報(bào)告基因序列擴(kuò)增及功能檢測(cè)
            3.3.2 載體pLoxP-2A-A的構(gòu)建
            3.3.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增及活性檢測(cè)
            3.3.4 Nramp1 細(xì)胞特異性表達(dá)載體pLoxP-2A-N構(gòu)建及其功能驗(yàn)證
        3.4 討論
        3.5 結(jié)論
    第四章 轉(zhuǎn)牛Nramp1 基因成纖維細(xì)胞株篩選及鑒定
        4.1 材料
            4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織細(xì)胞
            4.1.2 菌株和質(zhì)粒
            4.1.3 主要試劑
            4.1.4 引物設(shè)計(jì)
        4.2 方法
            4.2.1 新生荷斯坦奶牛成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            4.2.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細(xì)胞篩選
            4.2.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細(xì)胞株鑒定
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 新生荷斯坦奶牛成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            4.3.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細(xì)胞篩選
            4.3.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因成纖維細(xì)胞鑒定
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 轉(zhuǎn)Nramp1 基因牛的生產(chǎn)與鑒定
        5.1 材料
            5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織細(xì)胞
            5.1.2 菌株和質(zhì)粒
            5.1.3 主要試劑
            5.1.4 引物設(shè)計(jì)
        5.2 方法
            5.2.1 SCNT胚胎體外培養(yǎng)條件優(yōu)化
            5.2.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因重構(gòu)胚的培養(yǎng)
            5.2.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因牛生產(chǎn)及鑒定
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 培養(yǎng)液添加Vit-C對(duì)牛SCNT胚胎發(fā)育的影響
            5.3.2 轉(zhuǎn)Nramp1 基因克隆胚的制備
            5.3.3 轉(zhuǎn)Nramp1 基因克隆牛的生產(chǎn)
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新之處與進(jìn)一步研究的課題
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略 詞
致謝
作者簡(jiǎn)介

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 ;Development of the SCNT Embryo from Butyrolactone Ⅰ Prematured Bovine Oocytes[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2012年02期

2 王志蕊;劉西梅;周荊榮;鄭新民;魏慶信;董發(fā)明;畢延震;;Cre-LoxP重組系統(tǒng)刪除內(nèi)源性選擇標(biāo)記基因的效能評(píng)價(jià)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2014年02期

3 James D Falvey;Robert W Bentley;Tony R Merriman;Mark B Hampton;Murray L Barclay;Richard B Gearry;Rebecca L Roberts;;Macrophage migration inhibitory factor gene polymorphisms in inflammatory bowel disease: An association study in New Zealand Caucasians and meta-analysis[J];World Journal of Gastroenterology;2013年39期

4 劉明軍;張雪梅;李文蓉;黃俊成;汪立芹;;綿羊轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建及研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年21期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 程祥;牛Nramp1基因的分子克隆及其功能驗(yàn)證[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2857613