豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種急性傳染病,引起新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及死亡,妊娠母豬死胎、流產(chǎn)、木乃伊胎,成年豬常為隱形感染。豬偽狂犬病毒血清型單一,疫苗免疫保護(hù)率高,目前,市場(chǎng)上廣泛使用是基因缺失活疫苗,尤其是gE基因缺失苗,鑒于此,臨床上用于區(qū)分疫苗株感染和野生毒株感染的診斷方法的建立顯得尤為重要。本研究以本實(shí)驗(yàn)室新分離得到的PRV毒株(PRV-TX)為基礎(chǔ),表達(dá)并純化gE蛋白,制備針對(duì)PRVgE蛋白的單克隆抗體,并利用單抗建立檢測(cè)PRVgE抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,對(duì)豬偽狂犬病的防制具有重要意義。1、豬偽狂犬病毒gE基因的原核表達(dá)根據(jù)Genbank發(fā)表的PRVgE基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,擴(kuò)增PRVgE基因的主要抗原區(qū)域,約為500bp�？寺〉絧ET-32a表達(dá)載體上,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-gE,將pET-32a-gE轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,在16℃、220 rpm條件下,經(jīng)1 mM濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得大約45 kDa大小的可溶性gE蛋白,純化獲得濃度為2.6 mg/ml的gE純化蛋白。2、豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的制備將純化后gE蛋白免疫6周齡BALB/c雌性小鼠,將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合,通過(guò)間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,并用有限稀釋法進(jìn)行三次亞克隆,最終獲得了 6株能穩(wěn)定分泌抗PRVgE蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為2B4、3E5、4E6、5C5、5D6和5F9。間接ELISA檢測(cè)6株雜交瘤細(xì)胞的腹水效價(jià)分別為1:64000、1:32000、1:64000、1:16000、1:16000和1:32000,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,6株單克隆抗體腹水均能與PRV病毒蛋白發(fā)生特異性反應(yīng);間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)結(jié)果顯示,2B4、5C5、5D6、5F9和4E6單克隆抗體能與PRV發(fā)生特異性反應(yīng)。3、競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的初步建立以PK-15細(xì)胞增殖PRV,將收獲的病毒用蔗糖密度梯度超速離心法進(jìn)行純化,將純化的病毒作為包被抗原,純化2B4單抗腹水以辣根過(guò)氧化酶(HRP)進(jìn)行標(biāo)記作為檢測(cè)抗體,建立針對(duì)gE抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA。對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定抗原的最適包被濃度為0.313 mg/ml,酶標(biāo)抗體的最適工作濃度為1:800,待檢血清最適稀釋度為1:16,血清反應(yīng)的最佳時(shí)間為60 min,封閉液的最佳選擇為2%BSA,顯色液的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min。并測(cè)得該檢測(cè)方法的陰陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑制率≧40%為陽(yáng)性,反之則為陰性。運(yùn)用本方法檢測(cè)PCV-1、PRRSV、PPV、CSFV、PEDV和PCV-2陽(yáng)性血清樣品時(shí),結(jié)果均為陰性,說(shuō)明該方法具有較好的特異性。用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)IDEXX公司試劑盒檢測(cè)為PRV gE陽(yáng)性的90份血清,PRV gB陽(yáng)性的60份血清以及PRV陰性的70份血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,PRVgE陽(yáng)性血清陽(yáng)性符合率為96.67%,PRVgE陰性血清陰性符合率為93.85%。綜上,建立的方法特異性良好,可用于豬群PRVgE抗體的檢測(cè),用于區(qū)分自然感染和免疫動(dòng)物,為偽狂犬病的凈化提供了有效方法。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

２５０ｂｐ——??Ｈ）〇ｂｐ—？?．－?＿?Ｈ??圖１－２．重組質(zhì)粒酶切鑒定圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－４：?ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ?重組質(zhì)粒??Ｆｊｇ．１－２．?Ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ?：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?；?１?－４?：?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｏｆ?ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ??３．３?ｇＥ基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建??將陽(yáng)性測(cè)序正確的ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ質(zhì)粒與原核表達(dá)載體ＰＥＴ－３２ａ分別用Ｂ＿ＨＩ、Ｈ／？ｄＩＩＩ??限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用１?％瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒分別對(duì)目的??基因與表達(dá)載體ＤＮＡ進(jìn)行膠回收，用Ｔ４連接酶對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化??ＢＬ２１，搖菌擴(kuò)增之后提質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Ｂ〃ｗＨＩ、Ｈ／ｎｄＩＩＩ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果如??圖１－３所示，獲得５５８?ｂｐ大小的條帶，與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２?３?４??［丄ｄ?ｒ??ｔ＂?

基因與表達(dá)載體ＤＮＡ進(jìn)行膠回收，用Ｔ４連接酶對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化??ＢＬ２１，搖菌擴(kuò)增之后提質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Ｂ〃ｗＨＩ、Ｈ／ｎｄＩＩＩ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果如??圖１－３所示，獲得５５８?ｂｐ大小的條帶，與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２?３?４??［丄ｄ?ｒ??ｔ＂?，：＇ｆ?＂Ｉ—５９００ｂｐ??ｌＯＯＯｂｐ—卜Ａ．．??圖１－３．重組表這質(zhì)粒酶切鑒定圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－４：?ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ?重組質(zhì)粒??Ｆｉｇ．?１－３．?Ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?－４：?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｏｆ?ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ??３．４蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)??將重組菌培養(yǎng)至ＯＤ６００的值在０．４－０．６之間，加入終濃度為１．０?ｍｒｎｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，于??

２２０ｒｐｍ誘導(dǎo)表達(dá)８ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結(jié)果顯示，含Ｈｉｓ標(biāo)簽蛋白的重組菌ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ??經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后比未誘導(dǎo)菌多出一條約４５?ｋＤａ的蛋白條帶，誘導(dǎo)的空載體菌比未誘導(dǎo)菌多??出一條約１３?ｋＤａ的蛋白條帶，結(jié)果均與預(yù)期大小一致（圖１－４）。??Ｍｌ?２?３?４??５５?懸＿?：：?．?，１??、”，?機(jī)－你為：、＾?愛(ài)．??４０?＇?ｉ?ｍｍ?—４５ＫＤａ??泛＂、：＇??３５?ＭＭ＇??２５??圖１－４融合蛋白表達(dá)的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳??Ｍ?：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：未誘導(dǎo)的?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１；??２：?ＩＰＴＧ?誘導(dǎo)的?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１；?３：未誘導(dǎo)的?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１；??４：?ＩＰＴＧ?誘導(dǎo)的?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１；??Ｆｉｇ．?１－４?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１?ｂｅｆｏｒｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??２：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１?ａｆｔｅｒ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；?３：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１?ｂｅｆｏｒｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??４：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１?ａｆｔｅｒ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??３．５重組蛋白的可溶性分析??經(jīng)誘導(dǎo)條件的不斷摸索，得出ＩＰＴＧ濃度為１．０＿〇１／Ｌ，溫度１６°Ｃ，轉(zhuǎn)速為２２０ｒｐｍ??誘導(dǎo)時(shí)間８?ｈ是最佳誘導(dǎo)條件
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐璇;董靜;白娟;王先煒;姜平;;兩株抗豬偽狂犬病毒的單克隆抗體制備與鑒定[J];畜牧與獸醫(yī);2017年05期

2 李彩虹;何文;何柯瑾;;新型豬偽狂犬病毒的分離與鑒定[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2017年12期

3 楊偉翔;王權(quán);;變異豬偽狂犬病毒的分離鑒定分析[J];畜牧獸醫(yī)科學(xué)(電子版);2017年08期

4 楊曉天;石治華;;一例豬偽狂犬病毒病的診治[J];中國(guó)畜禽種業(yè);2016年01期

5 邊傳周,王惠杰,陳創(chuàng);豬偽狂犬病毒河南株的分離與鑒定[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年03期

6 付薇;胡曉靜;朱偉;潘杰;龍劍明;王常偉;劉棋;;廣西豬偽狂犬病毒感染狀況調(diào)查報(bào)告[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2008年06期

7 姚衛(wèi)東,田榮福,于國(guó)明;豬偽狂犬病毒的分子生物學(xué)進(jìn)展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2002年04期

8 覃國(guó)喜;;一例豬偽狂犬病毒病的診治報(bào)告[J];中國(guó)動(dòng)物保健;2014年09期

9 劉志杰;李如舉;周莉;曾智勇;湯德元;王彬;甘振磊;王鳳;;豬偽狂犬病毒病與圓環(huán)病毒病2型混合感染的診斷[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年11期

10 周泰沖;豬偽狂犬病毒對(duì)人的感染性問(wèn)題(綜述)[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;1987年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄭蘭蘭;重組PCV2 ORF2和IL-18基因PRV的構(gòu)建及免疫效果研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡慶云;豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

2 黃江;豬偽狂犬病毒的分離鑒定和熒光定量PCR方法的建立及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 陳海超;抗豬偽狂犬病毒卵黃抗體的制備及其保護(hù)效力的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 劉曉慧;豬偽狂犬病毒冀A株gD基因的克隆、表達(dá)及檢測(cè)[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 邱佳;豬偽狂犬病毒gB基因主要抗原區(qū)的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備[D];黑龍江大學(xué);2013年

6 張青占;變異豬偽狂犬病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 王鳳求;豬偽狂犬病毒GDHD-1株的分離鑒定與致病性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 邱陽(yáng);福建省部分地市豬偽狂犬病毒gE血清調(diào)查及免疫效果分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

9 裴麗華;豬偽狂犬病毒gE基因亞克隆、原核表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 位玉玲;唾液中豬偽狂犬病毒熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2854425