本研究通過設(shè)計和構(gòu)建基因組結(jié)構(gòu)與野生型APV-1病毒相同,但在APV-1晚期基因agno-1a翻譯起始ATG有突變的新型重組病毒,來研究APV-1晚期基因agno-1a對該病毒晚期多順反子翻譯起始調(diào)控的機(jī)制。首先大量提取APV-1的cDNA病毒克隆pHL1003質(zhì)粒DNA,用限制性內(nèi)切酶AccI(部分酶切)和EcoRI(完全酶切)對質(zhì)粒pHL1003進(jìn)行分步酶切,得到pHL1003載體大片段。通過PCR的方法用含起始密碼ATG點(diǎn)突變(ACG或CTG)的設(shè)計引物擴(kuò)增目的小片段并用限制性內(nèi)切酶AccI和EcoRI進(jìn)行雙酶切,然后連入pUC19載體中,以此準(zhǔn)確獲取含ACG或CTG的目的小片段。最后,用T4連接酶將突變目的小片段與pHL1003載體大片段相連接,構(gòu)建能進(jìn)行真核表達(dá)的重組cDNA病毒載體。將構(gòu)建的含ATG突變的cDNA病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細(xì)胞后,用Western blot來檢測重組病毒基因的蛋白表達(dá)變化。用限制性內(nèi)切酶NdeI和NarI對質(zhì)粒pHL1003-GFP和pHL1003突變體分別進(jìn)行雙酶切,獲得所需要的載體大片段和目的小片段。再將突變目的片段(ATG→CTG;ATG→ACG)與pHL1003-GFP載體片段分別相連構(gòu)建含報告基因EGFP的表達(dá)載體(即用GFP基因替代VPs基因)。通過轉(zhuǎn)染鵪鶉胚成纖維細(xì)胞后使用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)量。結(jié)果表明,質(zhì)粒pHL1003表達(dá)了VP1/2和Agno-1a三種蛋白,VP1為最大量的蛋白;質(zhì)粒pHL1003-CTG也表達(dá)了Agno-1a和VP1蛋白,但VP1的數(shù)量和比例要比Agno-1a蛋白的表達(dá)量要少很多。三種APV-1 cDNA-GFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鵪鶉?yán)w維細(xì)胞后,pHL1003-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白量較多。而質(zhì)粒pHL1003-GFP-CTG和pHL1003-GFP-ACG轉(zhuǎn)染鵪鶉胚纖維細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)量比pHL1003-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)熒光蛋白量要少的多。因此,在APV-1晚期基因中agno-1a ATG突變明顯影響著下游基因的翻譯表達(dá)。這暗示了Agno-1a蛋白作為病毒晚期多順反子基因的前導(dǎo)蛋白可能對其下游基因(GFP或VPs)的翻譯表達(dá)起關(guān)鍵的調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖 1.1 APV 全基因組線性圖[44]Fig 1.1 avian polyomavirus genome map[44]APV-1 病毒與哺乳類動物多瘤病毒 SV40，在結(jié)構(gòu)上都具備了，外顯子和內(nèi)含子，和含有基因序列不連續(xù)的特點(diǎn)。在 DNA 啟動轉(zhuǎn)錄后，需要將內(nèi)含子去除

圖 1.2 在 PL1 啟動下的雙順反子 a 和三順反子 b[45]Fig 1.3Under the PL1 promoter, the a (Three CIS trans) and the b (CIS)[45]在進(jìn)一步的研究中，設(shè)計關(guān)于 APV-1 病毒在感染的宿主雞胚成纖維細(xì)胞CEF 中的動力學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察病毒蛋白表的達(dá)，并利用 Western Blot 的方法檢測

圖 1.3APV-1 病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞不同時間段的瞬時蛋白表達(dá)量[45]1.3 Transient APV-1 viral expression of chicken infected with virus at different time 的起始機(jī)制
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2854805