隨著社會發(fā)展,人們對高品質(zhì)豬肉的需求日益增加。外來品種豬生長速度快,肉的口感卻不佳,而我國地方品種豬肉質(zhì)優(yōu)良,但生長速度慢、瘦肉率低。雜交育種可快速提高豬肉品質(zhì),而研究與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的分子機制可加快雜交育種進程,充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢。研究表明,有諸多基因可影響骨骼肌生長發(fā)育,其中WFIKKN2蛋白通過結(jié)合肌肉生長抑制素調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育。WFIKKN2基因又稱生長分化因子相關(guān)血清蛋白1(GASP1),屬于FS家族。本實驗以同日齡杜洛克豬、陸川豬及正反交F1代為研究對象,檢測WFIKKN2的啟動子活性,比較不同豬背最長肌WFIKKN2基因表達差異,從DNA甲基化角度研究mRNA表達差異機制,并對WFIKKN2基因進行了相關(guān)生物信息學(xué)分析,構(gòu)建陸川豬WFIKKN2基因的組織表達譜,研究不同組織甲基化水平,以期為今后豬育種工作提供理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:1.截取發(fā)布于NCBI上豬WFIKKN2基因5'端上游1819bp調(diào)控序列作為啟動子待研究區(qū)域,運用相關(guān)軟件預(yù)測該區(qū)域核心啟動子位置、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點以及TATA-box等結(jié)構(gòu)。實驗成功克隆了杜洛克豬、陸川豬及正反交F1代的WFIKKN2基因啟動子區(qū)1819bp序列。實驗利用啟動子雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證啟動子活性,結(jié)果表明四種豬的WFIKKN2基因啟動子待研究區(qū)域均具有活性,且杜洛克豬和正交杜陸豬的啟動子待研究區(qū)域活性均顯著低于陸川豬和反交陸杜豬(P0.05);2.利用實時定量PCR檢測WFIKKN2基因在四種豬背最長肌中mRNA表達量,發(fā)現(xiàn)杜洛克豬與正交杜陸豬WFIKKN2基因表達量均顯著低于陸川豬和反交陸杜豬(P0.05)。通過在線軟件預(yù)測到WFIKKN2基因啟動子區(qū)存在一個長度為526bp的CpG島,采用重亞硫酸鹽測序法檢測四種豬背最長肌中的WFIKKN2基因啟動子CpG島整體甲基化水平,發(fā)現(xiàn)杜洛克豬與正交杜陸豬CpG島整體甲基化率均顯著高于陸川豬和反交陸杜豬(P0.05),且甲基化水平與mRNA表達量呈顯著負相關(guān)。為進一步探究CpG島甲基化水平是否影響啟動子活性,本實驗以杜洛克豬和陸川豬背最長肌組織DNA為模板,構(gòu)建包含CpG島的啟動子缺失片段熒光素酶報告基因載體。驗證啟動子缺失片段活性,發(fā)現(xiàn)杜洛克豬活性顯著低于陸川豬(P0.05)。預(yù)測發(fā)現(xiàn)CpG島序列中存在多個SP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,推測WFIKKN2基因啟動子CpG島甲基化影響SP1轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合,導(dǎo)致啟動子活性降低從而抑制mRNA表達。3.實驗成功克隆陸川豬和杜洛克豬WFIKKN2基因CDS區(qū),生物信息學(xué)分析表明陸川豬WFIKKN2基因CDS區(qū)長度為1743bp,編碼580個氨基酸;陸川豬核苷酸序列與杜洛克豬相比共有15處堿基不同,其中7處為錯義突變;WFIKKN2基因在不同哺乳動物中保守性強;WFIKKN2蛋白具有親水性,屬于分泌蛋白;氨基酸序列中存在多個潛在糖基化與磷酸化位點,這些位點可能影響WFIKKN2蛋白生物學(xué)功能。實驗構(gòu)建了陸川豬WFIKKN2基因組織表達譜,表明該基因在不同組織中均有表達。通過BSP法檢測心臟和腎臟中WFIKKN2基因啟動子CpG島甲基化水平,發(fā)現(xiàn)心臟的CpG島整體甲基化率顯著小于腎臟(P0.05),而WFIKKN2基因在心臟中的表達量顯著高于在腎臟中的表達量(P0.05)。故推測在不同組織中,WFIKKN2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化也抑制mRNA表達。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

圖１－３杜陸豬和陸杜豬??Ｆｉｇ．?１－３?Ｄｕｌｕ?ｐｉｇ?ａｎｄ?Ｌｕｄｕ?ｐｉｇ??

被農(nóng)業(yè)部列入國家級遺傳資源保護品種［ＩＧ，ｎ］。陸川豬繁殖性能強，初產(chǎn)母豬平均產(chǎn)仔數(shù)??達１０．１７頭，經(jīng)產(chǎn)母豬平均產(chǎn)仔數(shù)達１２．４２頭，在育種中通常作為母本［１２］。本實驗所用??陸川豬見圖１－２。??雜交Ｆ１代正交杜陸豬和反交陸杜豬分別以杜洛克豬和陸川豬作父本雜交而成，全??身為黑色，研究表明雜交后代在瘦肉率、屠宰率和體型方面偏向于杜洛克豬，在肉品質(zhì)??方面，低于陸川豬但優(yōu)于杜洛克豬，遺傳陸川豬肉品質(zhì)好和繁殖力高等性狀，但正反交??豬在肉質(zhì)方面差異不顯著［１３］。本實驗所用正反交豬見圖１－３，圖中左側(cè)為正交杜陸豬，??右側(cè)為反交陸杜豬。??圖１－１杜洛克豬?圖１－２陸川豬??Ｆｉｇ．?１－１?Ｄｕｒｏｃ?Ｆｉｇ．?１－２?Ｌｕｃｈｕａｎ?ｐｉｇ??ＭＢ??ｆ：??圖１－３杜陸豬和陸杜豬??Ｆｉｇ．?１－３?Ｄｕｌｕ?ｐｉｇ?ａｎｄ?Ｌｕｄｕ?ｐｉｇ??２??

１５７１?１６２１?０．９８?ＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＭＴＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴ??１６３６?１６８６?０．９５?ＧＧＡＧＣＩＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧ??圖２－２?ＷＦＩＫＫＮ２基因核心啟動子區(qū)域預(yù)測??Ｆｉｇ．?２－２?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｃｏｒｅ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ＷＦＩＫＫＮ２?ｇｅｎｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??２．３．１．２?ＷＦＩＫＫＮ２基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及ＴＡＴＡ－ｂｏｘ預(yù)測??利用?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｃａｎ、ＡｌｉＢａｂａ２．１、Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ?軟件預(yù)測?ＷＦＩＫＫＮ２?基因?１８１９ｂｐ?啟動子??區(qū)域存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及ＴＡＴＡ－ｂｏｘ，預(yù)測結(jié)果顯示，該區(qū)域存在多個轉(zhuǎn)錄因??子結(jié)合位點，當(dāng)ＴＡＴＡ－ｂｏｘ的閾值設(shè)置為０．８時，在１６１２ｂｐ位置存在一處ＴＡＴＡ－ｂｏｘ結(jié)??構(gòu)
【參考文獻】

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本文編號：2853209