2010年首次在小鼠上發(fā)現(xiàn)新型NOD樣受體NLRC5基因,NLRC5是NLR家族最大的成員,大量研究表明NLRC5在固有免疫和獲得性免疫中有重要的作用,但其自身的調(diào)控機(jī)制尚不明了,因此為了探究NLRC5基因啟動(dòng)子自身調(diào)控原理,本研究首先檢測(cè)了雞NLRC5基因在雞不同組織中的表達(dá)特異性,利用軟件預(yù)測(cè)NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的CpG島,并通過(guò)亞硫酸氫鹽修飾后BSP檢測(cè)DF1和HD11細(xì)胞中NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),利用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-cd處理細(xì)胞,比較甲基化程度與基因表達(dá)的關(guān)系,并最終通過(guò)啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)、定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)驗(yàn)證甲基化影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。克隆了NLRC 起始密碼子前2265 bp的啟動(dòng)子區(qū),構(gòu)建啟動(dòng)子區(qū)系列缺失載體,轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞,根據(jù)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定不同缺失片段活性高低從而確定關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域,預(yù)測(cè)分析關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域內(nèi)可能存在的反式作用元件,利用啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)、定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)驗(yàn)證順式元件及對(duì)NLRC5啟動(dòng)子活性的影響。最后通過(guò)LPS和IFN-y處理HD11細(xì)胞,RT-qPCR以及ELISA確定NF-κB激活條件,并驗(yàn)證雞NLRC5基因啟動(dòng)子區(qū)NF-κB順式作用元件,結(jié)果表明:1.RT-qPCR檢測(cè)到NLRC5在雞脾臟、肝臟等免疫相關(guān)組織的表達(dá)量顯著高于心臟、肌肉等組織,并且檢測(cè)NLRC5基因在雞巨噬細(xì)胞系HD11中的表達(dá)量顯著高于雞成纖維細(xì)胞系DF-1。2.為探討NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn),其中MethPrimer 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) 2 個(gè) CpG 島:-4060 到-3428,共 663 bp 和-3344 到-3027,共 318 bp;BSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DF1處于高甲基化狀態(tài),而HD11甲基化水平較低,利用不同濃度甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-cd處理兩種細(xì)胞,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率,定量檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)40μmol/L終濃度5-aza-cd處理?xiàng)l件下,細(xì)胞DF-1存活率相比對(duì)照組差異極顯著(P0.01),并對(duì)處理細(xì)胞進(jìn)行甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具體甲基化降低位點(diǎn)。并最終構(gòu)建該區(qū)域缺失載體轉(zhuǎn)染雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)、定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的方法確定甲基化通過(guò)E2F轉(zhuǎn)錄因子影響NLRC5基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。3.為尋找NLRC5啟動(dòng)子-2265到-1區(qū)域的潛在調(diào)控元件,利用JASPAR軟件分析發(fā)現(xiàn)NLRC5啟動(dòng)子-2265到-1間可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建缺失載體進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定三個(gè)活性較高的區(qū)域,啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在-459區(qū)域存在STAT1轉(zhuǎn)錄因子,針對(duì)該核心區(qū)域的順式元件STAT1的點(diǎn)突變和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了該區(qū)域內(nèi)存在STAT1順式元件,其在NLRC5基因啟動(dòng)子活性調(diào)控過(guò)程中能夠發(fā)揮重要作用。4.為尋找NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用過(guò)表達(dá)結(jié)合缺失載體確定NF-κB可能結(jié)合區(qū)域,利用脂多糖(LPS)和干擾素γ(IFN-γ)刺激雞巨噬細(xì)胞HD11,發(fā)現(xiàn)10ng/mlLPS刺激8小時(shí)和1ng/mlLPS+10ng/mlIFN-γ刺激12小時(shí)能有效激活細(xì)胞中的NF-κB,最終EMSA驗(yàn)證-2423和-2342存在兩個(gè)NF-κB反式作用元件。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

圖１－２?ＮＬＲ家族分子結(jié)構(gòu)模式圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＮＬＲ?ｆａｍｉｌｙ??

熒光定量結(jié)果顯示，雞＃Ｚｉ？Ｃ５基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄和分布明顯不同，各個(gè)組織之??間表達(dá)差異極顯著（ＰＣＯ．Ｏｌ），在脾臟表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織（Ｐ＜０．０１），其次在肝臟??和胸腺中表達(dá)也較高（尸＜０．０１?），而在胸腿肌以及肺臟（ＰＣ０．０１）中轉(zhuǎn)錄量較低（圖２－２），??表明其在免疫相關(guān)組織中表達(dá)量較多，而在肌肉等組織中幾乎不表達(dá)。而ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ結(jié)果??（圖２－３），發(fā)現(xiàn)其蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)和定量結(jié)果一致。??

?＜〇?＜＜＞?＼??Ｔｉｓｓｕｅ??圖２－２雞ｊＶｉｉ？Ｃ５?ｍＲＮＡ在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量??Ｆｉｇｕｒｅ２－２?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＴＶＩｉＪＣＪ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ??注：１－１１：分別為睪丸（卵巢）、脾臟、腎臟、法氏囊、腸、肺臟、胸腺、肝臟、心臟＇胸肌，腿??肌。不同字母表示差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。??１－１１?：Ｔｅｓｔｉ，ｓｐｌｅｅｎ？ｋｉｄｎｅｙ，ｆａｂｒｉｃｉｕｓ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．ｌｕｎｇ，ｔｈｙｍｕｓ，ｌｉｖｅｒ，ｈｅａｒｔ．ｐｅｃｔｏｒａｌｅｓ，ｃｒｕｒｅｕｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｅｔｔｅｒｓ??ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｔｈａｔ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ?ｉｓ?ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?（Ｐ＜０．０１）??肺肝脾肌肉胸腺腎腸??ＮＬＲＣ５?＊??ＧＡＰＤＨ?轉(zhuǎn)麵翻麵麵睡麵麵??圖２－３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂ?ｌｏｔ檢測(cè)雞規(guī)仉巧蛋白在不同組織中的表達(dá)量??Ｆｉｇｕｒｅ２－３?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＮＬＲＣ５?ｐ
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本文編號(hào)：2853091