泰勒蟲(chóng)病是由媒介蜱傳播的泰勒蟲(chóng)寄生于宿主紅細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞所引起的血液原蟲(chóng)病,發(fā)病動(dòng)物以發(fā)熱、貧血、黃疸、體表淋巴結(jié)腫脹,甚至死亡,為典型臨床癥狀。據(jù)報(bào)道,梨形蟲(chóng)病每年在全世界范圍內(nèi)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失,包括動(dòng)物死亡、生產(chǎn)性能下降及防治費(fèi)用。因此,建立快速特異的診斷檢測(cè)方法,并對(duì)牛泰勒蟲(chóng)病的流行情況進(jìn)行調(diào)查,闡明中國(guó)和巴基斯坦兩國(guó)部分地區(qū)的梨形蟲(chóng)種類(lèi)與分布特征,可為牛梨形蟲(chóng)病的防控提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。依據(jù)環(huán)形泰勒蟲(chóng)烯醇化酶基因序列,設(shè)計(jì)引物,建立了可擴(kuò)增大小281bp基因片段的RPA快速檢測(cè)方法。對(duì)建立的RPA方法和常規(guī)PCR方法的檢測(cè)效果進(jìn)行了對(duì)比,通過(guò)對(duì)274份野外樣本的檢測(cè),RPA方法檢測(cè)出48份陽(yáng)性樣品(17.51%),常規(guī)PCR檢測(cè)出21份環(huán)形泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性樣品(7.66%),結(jié)果顯示RPA檢測(cè)方法的敏感性明顯高于常規(guī)PCR。為證實(shí)RPA檢測(cè)結(jié)果的正確性,對(duì)RPA檢測(cè)呈陽(yáng)性而常規(guī)PCR為陰性的樣品進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。在野外環(huán)境下,環(huán)形泰勒蟲(chóng)與東方泰勒蟲(chóng)經(jīng)常以混合感染的情況出現(xiàn)。為能夠同時(shí)并鑒別診斷兩種泰勒蟲(chóng),本研究中建立了能夠同時(shí)檢測(cè)環(huán)形泰勒蟲(chóng)和東方泰勒蟲(chóng)的多重RPA檢測(cè)方法。根據(jù)兩種泰勒蟲(chóng)的烯醇化酶基因序列,分別設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增引物,其中,環(huán)形泰勒蟲(chóng)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為282 bp,東方泰勒蟲(chóng)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229 bp。特異性試驗(yàn)證實(shí),該方法可特異性地?cái)U(kuò)增兩種泰勒蟲(chóng),而與其他梨形蟲(chóng)DNA無(wú)交叉反應(yīng),特異性良好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該多重RPA檢測(cè)方法最低能夠檢出100拷貝的烯醇化酶基因的質(zhì)粒DNA,具有較好的檢測(cè)敏感性。為驗(yàn)證多重RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值,分別用建立的多重RPA方法和已報(bào)道的多重PCR檢測(cè)方法,對(duì)188份樣品中環(huán)形泰勒蟲(chóng)和東方泰勒蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。多重RPA檢測(cè)出環(huán)形泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性樣品45份(23.9%)和東方泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性樣品5份(2.6%)。多重PCR方法檢測(cè)出環(huán)形泰勒陽(yáng)性32份(17%)和東方泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性3份(1.6%)。為了解巴基斯坦梨形蟲(chóng)病的流行情況,在Chakwal、Jhang和Faisalabad三個(gè)地區(qū),選擇有蜱叮咬但無(wú)臨床癥狀的牛,用FTA卡共采集血液樣品450份。應(yīng)用已發(fā)表的針對(duì)梨形蟲(chóng)18S rRNA V4高變區(qū)的巢式PCR方法,對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果顯示,在樣品采集地區(qū)主要存在環(huán)形泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)。采集的樣品中,梨形蟲(chóng)病病原的陽(yáng)性率為28.44%(128/450)。其中環(huán)形泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為22.89%、東方泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為3.11%、雙芽巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率為2.44%。樣品采集的三個(gè)地區(qū)中,Chakwal地區(qū)梨形蟲(chóng)病流行情況最為嚴(yán)重,梨形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率達(dá)58.51%。為進(jìn)一步了解巴基斯坦和中國(guó)地區(qū)梨形蟲(chóng)病病原的基因相關(guān)性。從中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)的120份樣品中篩選出梨形蟲(chóng)陽(yáng)性DNA樣品16份,與巴基斯坦地區(qū)篩選出的梨形蟲(chóng)基因序列進(jìn)行基因相關(guān)性分析。核糖體18S rRNA全長(zhǎng)序列和棒狀體相關(guān)蛋白基因分別用于泰勒蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)的基因相關(guān)性分析。采用以重組的主要梨形蟲(chóng)表面蛋白(rMPSP)為抗原建立的間接ELISA方法,對(duì)來(lái)自西藏、新疆和內(nèi)蒙3個(gè)省份44個(gè)地區(qū)的840份牛血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,樣品的平均陽(yáng)性率為18.57%。新疆、內(nèi)蒙和西藏的陽(yáng)性率分別為27%、14%和10.94%。本項(xiàng)研究結(jié)果,可為巴基斯坦和我國(guó)牛泰勒蟲(chóng)病防控提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S858.23
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION
    1.1 Taxonomy and biological features of piroplasms
    1.2 Piroplasm infecting ruminants
        1.2.1 Theileria
        1.2.2 Babesia
        1.2.3 Life Cycle of Piroplasms
    1.3 Distribution of piroplasm species
    1.4 Diagnostic methods to detect and identify piroplasm species
        1.4.1 Conventional techniques
        1.4.2 Serological assays
        1.4.3 Molecular assays
    1.5 Piroplasm detection studies
        1.5.1 Piroplasm detection in China
        1.5.2 Piroplasm detection in Pakistan
    1.6 Piroplasma Control
        1.6.1 Vector control
        1.6.2 Babesia and Theileria control
CHAPTER Ⅱ DEVELOPMENT OF RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    2.1 Introduction
    2.2 Materials and methods
        2.2.1 Parasites
        2.2.2 Samples collection
        2.2.3 Detection of Theileria annulata by RPA
        2.2.4 Sensitivity of RPA
        2.2.5 Specificity of RPA
        2.2.6 Field samples screening
        2.2.7 Statistical analysis
    2.3 Results
        2.3.1 Specificity of RPA
        2.3.2 Sensitivity of RPA
        2.3.3 Results of field samples
    2.4 Discussion
CHAPTER Ⅲ DEVELOPMENT OF MULTIPLEX RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    3.1 Introduction
    3.2 Materials and methods
        3.2.1 Parasites
        3.2.2 Samples collection
        3.2.3 Simultaneous detection of T. annulata and T. orientalis
        3.2.4 Sensitivity of multiplex RPA
        3.2.5 Specificity of multiplex RPA
        3.2.6 Field samples screening
    3.3 Results
        3.3.1 Specificity of multiplex RPA
        3.3.2 Sensitivity of multiplex RPA
        3.3.3 Results of field samples
    3.4 Discussion
CHAPTER Ⅳ MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF PIROPLASM SPECIES
    4.1 Introduction
    4.2 Materials and methods
        4.2.1 Samples collection
        4.2.2 Genomic DNA extraction
        4.2.3 Primer design
        4.2.4 PCR amplification, cloning and sequencing
        4.2.5 Confirmation and sequence analysis of positive samples
        4.2.6 Phylogenetic analysis
        4.2.7 Species confirmation
        4.2.8 Nucleotide accession numbers
    4.3 Results
        4.3.1 Detection and identification of parasite in samples collected from Pakistan
        4.3.2 Detection and identification of parasite in samples collected from China
    4.4 Discussion
CHAPTER Ⅴ SEROLOGICAL DETECTION OF THEILERIOSIS
    5.1 Introduction
    5.2 Materials and methods
        5.2.1 Parasites
        5.2.2 Sera and genomic DNAs
        5.2.3 Cloning and expressing MPSP gene
        5.2.4 Western blotting
        5.2.5 ELISA procedure
    5.3 Results
        5.3.1 Serological prevalence of Theileriosis
    5.4 Discussion
CONCLUSION
REFERENCES
ACKNOWLEDGEMENTS
CURRICULUM VITAE

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本文編號(hào)：2852924