泰勒蟲病是由媒介蜱傳播的泰勒蟲寄生于宿主紅細胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞所引起的血液原蟲病,發(fā)病動物以發(fā)熱、貧血、黃疸、體表淋巴結(jié)腫脹,甚至死亡,為典型臨床癥狀。據(jù)報道,梨形蟲病每年在全世界范圍內(nèi)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失,包括動物死亡、生產(chǎn)性能下降及防治費用。因此,建立快速特異的診斷檢測方法,并對牛泰勒蟲病的流行情況進行調(diào)查,闡明中國和巴基斯坦兩國部分地區(qū)的梨形蟲種類與分布特征,可為牛梨形蟲病的防控提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。依據(jù)環(huán)形泰勒蟲烯醇化酶基因序列,設(shè)計引物,建立了可擴增大小281bp基因片段的RPA快速檢測方法。對建立的RPA方法和常規(guī)PCR方法的檢測效果進行了對比,通過對274份野外樣本的檢測,RPA方法檢測出48份陽性樣品(17.51%),常規(guī)PCR檢測出21份環(huán)形泰勒蟲陽性樣品(7.66%),結(jié)果顯示RPA檢測方法的敏感性明顯高于常規(guī)PCR。為證實RPA檢測結(jié)果的正確性,對RPA檢測呈陽性而常規(guī)PCR為陰性的樣品進行了測序驗證。在野外環(huán)境下,環(huán)形泰勒蟲與東方泰勒蟲經(jīng)常以混合感染的情況出現(xiàn)。為能夠同時并鑒別診斷兩種泰勒蟲,本研究中建立了能夠同時檢測環(huán)形泰勒蟲和東方泰勒蟲的多重RPA檢測方法。根據(jù)兩種泰勒蟲的烯醇化酶基因序列,分別設(shè)計了特異性擴增引物,其中,環(huán)形泰勒蟲的擴增片段長度為282 bp,東方泰勒蟲的擴增片段長度為229 bp。特異性試驗證實,該方法可特異性地擴增兩種泰勒蟲,而與其他梨形蟲DNA無交叉反應,特異性良好。敏感性試驗結(jié)果顯示,該多重RPA檢測方法最低能夠檢出100拷貝的烯醇化酶基因的質(zhì)粒DNA,具有較好的檢測敏感性。為驗證多重RPA檢測方法的應用價值,分別用建立的多重RPA方法和已報道的多重PCR檢測方法,對188份樣品中環(huán)形泰勒蟲和東方泰勒蟲的感染情況進行了檢測。多重RPA檢測出環(huán)形泰勒蟲陽性樣品45份(23.9%)和東方泰勒蟲陽性樣品5份(2.6%)。多重PCR方法檢測出環(huán)形泰勒陽性32份(17%)和東方泰勒蟲陽性3份(1.6%)。為了解巴基斯坦梨形蟲病的流行情況,在Chakwal、Jhang和Faisalabad三個地區(qū),選擇有蜱叮咬但無臨床癥狀的牛,用FTA卡共采集血液樣品450份。應用已發(fā)表的針對梨形蟲18S rRNA V4高變區(qū)的巢式PCR方法,對采集的樣品進行檢測。測序結(jié)果顯示,在樣品采集地區(qū)主要存在環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲。采集的樣品中,梨形蟲病病原的陽性率為28.44%(128/450)。其中環(huán)形泰勒蟲陽性率為22.89%、東方泰勒蟲陽性率為3.11%、雙芽巴貝斯蟲陽性率為2.44%。樣品采集的三個地區(qū)中,Chakwal地區(qū)梨形蟲病流行情況最為嚴重,梨形蟲感染陽性率達58.51%。為進一步了解巴基斯坦和中國地區(qū)梨形蟲病病原的基因相關(guān)性。從中國內(nèi)蒙古地區(qū)的120份樣品中篩選出梨形蟲陽性DNA樣品16份,與巴基斯坦地區(qū)篩選出的梨形蟲基因序列進行基因相關(guān)性分析。核糖體18S rRNA全長序列和棒狀體相關(guān)蛋白基因分別用于泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲的基因相關(guān)性分析。采用以重組的主要梨形蟲表面蛋白(rMPSP)為抗原建立的間接ELISA方法,對來自西藏、新疆和內(nèi)蒙3個省份44個地區(qū)的840份牛血清樣品進行了檢測。結(jié)果顯示,樣品的平均陽性率為18.57%。新疆、內(nèi)蒙和西藏的陽性率分別為27%、14%和10.94%。本項研究結(jié)果,可為巴基斯坦和我國牛泰勒蟲病防控提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.23
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION
    1.1 Taxonomy and biological features of piroplasms
    1.2 Piroplasm infecting ruminants
        1.2.1 Theileria
        1.2.2 Babesia
        1.2.3 Life Cycle of Piroplasms
    1.3 Distribution of piroplasm species
    1.4 Diagnostic methods to detect and identify piroplasm species
        1.4.1 Conventional techniques
        1.4.2 Serological assays
        1.4.3 Molecular assays
    1.5 Piroplasm detection studies
        1.5.1 Piroplasm detection in China
        1.5.2 Piroplasm detection in Pakistan
    1.6 Piroplasma Control
        1.6.1 Vector control
        1.6.2 Babesia and Theileria control
CHAPTER Ⅱ DEVELOPMENT OF RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    2.1 Introduction
    2.2 Materials and methods
        2.2.1 Parasites
        2.2.2 Samples collection
        2.2.3 Detection of Theileria annulata by RPA
        2.2.4 Sensitivity of RPA
        2.2.5 Specificity of RPA
        2.2.6 Field samples screening
        2.2.7 Statistical analysis
    2.3 Results
        2.3.1 Specificity of RPA
        2.3.2 Sensitivity of RPA
        2.3.3 Results of field samples
    2.4 Discussion
CHAPTER Ⅲ DEVELOPMENT OF MULTIPLEX RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    3.1 Introduction
    3.2 Materials and methods
        3.2.1 Parasites
        3.2.2 Samples collection
        3.2.3 Simultaneous detection of T. annulata and T. orientalis
        3.2.4 Sensitivity of multiplex RPA
        3.2.5 Specificity of multiplex RPA
        3.2.6 Field samples screening
    3.3 Results
        3.3.1 Specificity of multiplex RPA
        3.3.2 Sensitivity of multiplex RPA
        3.3.3 Results of field samples
    3.4 Discussion
CHAPTER Ⅳ MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF PIROPLASM SPECIES
    4.1 Introduction
    4.2 Materials and methods
        4.2.1 Samples collection
        4.2.2 Genomic DNA extraction
        4.2.3 Primer design
        4.2.4 PCR amplification, cloning and sequencing
        4.2.5 Confirmation and sequence analysis of positive samples
        4.2.6 Phylogenetic analysis
        4.2.7 Species confirmation
        4.2.8 Nucleotide accession numbers
    4.3 Results
        4.3.1 Detection and identification of parasite in samples collected from Pakistan
        4.3.2 Detection and identification of parasite in samples collected from China
    4.4 Discussion
CHAPTER Ⅴ SEROLOGICAL DETECTION OF THEILERIOSIS
    5.1 Introduction
    5.2 Materials and methods
        5.2.1 Parasites
        5.2.2 Sera and genomic DNAs
        5.2.3 Cloning and expressing MPSP gene
        5.2.4 Western blotting
        5.2.5 ELISA procedure
    5.3 Results
        5.3.1 Serological prevalence of Theileriosis
    5.4 Discussion
CONCLUSION
REFERENCES
ACKNOWLEDGEMENTS
CURRICULUM VITAE

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本文編號：2852924