分子印跡技術(shù)(MIT)是模擬酶與底物的特異性相互作用,合成對目標(biāo)分子(模板分子)具有“預(yù)定”選擇性的聚合物的技術(shù);以酶的特異性抑制劑為模板分子合成印跡聚合物(MIP),可模擬酶的活性中心,用于先導(dǎo)化合物的篩選。在本研究中,以流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑的前藥奧司他韋(OS)為模板分子,制備聚合物,以期模擬NA的活性中心,用于探討基于MIT篩選先導(dǎo)化合物的可行性及其機制。1.在硅膠表面制備了奧司他韋分子印跡聚合物(OSMIP@硅膠),紅外光譜、元素分析、掃描電鏡及多孔性分析等結(jié)果表明,所制備的OSMIP@硅膠為形狀均一、大小一致,具有多孔性特征的球形顆粒,其表面結(jié)構(gòu)與非印跡聚合物有顯著差異。2.將OSMIP@硅膠裝填液相色譜柱,與LC-MS在線聯(lián)用。結(jié)果顯示,該色譜柱的背景壓力較低,對模板分子OS的色譜行為得到顯著改善;對模板分子OS、帕拉米韋、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、甲氧芐啶等化合物具有較好的親和性;對阿昔洛韋、地蒽酚、阿司匹林丁香酚酯、阿司匹林、喹烯酮等化合物沒有親和性。3.靜態(tài)吸附試驗結(jié)果表明,OSMIP@硅膠中含有對模板分子OS的特異性吸附位點;對親和性化合物帕拉米韋、鹽酸小檗堿和甲氧芐啶也有特異性吸附位點,而對喹烯酮則無特異性吸附位點;熱力學(xué)試驗結(jié)果表明,OSMIP@硅膠對OS的吸附為優(yōu)惠吸附。4.體外條件下,NA抑制劑奧司他韋羧酸對NA具有良好的抑制活性;親和性化合物帕拉米韋(陽性對照),以及鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對NA均具有良好的抑制活性;非親和性化合物阿昔洛韋、阿司匹林丁香酚酯和喹烯酮等,則無相應(yīng)的NA抑制活性。但是,親和性化合物甲氧芐啶對NA亦無抑制活性。5.分子對接的結(jié)果顯示,在體外對NA有抑制活性的鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿,同奧司他韋羧酸、帕拉米韋等一樣,亦可與NA活性中的Asp151殘基形成強的相互作用;包括甲氧芐啶在內(nèi)的在體外無活性的其他化合物及其結(jié)構(gòu)類似物,則無法與NA活性中心形成有效的相互作用。6.表面等離子共振的結(jié)果顯示,模板分子OS,以及陽性藥物奧司他韋羧酸、帕拉米韋等均能夠與NA之間產(chǎn)生強的相互作用;具有NA抑制活性的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀亦可與之產(chǎn)生中等強度的相互作用;甲氧芐啶及其他化合物則與NA之間的相互作用較弱。綜上所述,在OSMIP@硅膠色譜柱上親和性較好的化合物,OSMIP@硅膠對其有特異性吸附作用;親和性較好的化合物在體外具有NA抑制活性,但也存在假陽性結(jié)果;親和性較好且有活性的化合物,能夠與NA活性中心包括Asp151殘基在內(nèi)的活性位點,產(chǎn)生強的相互作用;親和性較好且有活性的化合物能夠與NA產(chǎn)生中等強度以上的相互作用。以上結(jié)果表明,親和性化合物的結(jié)構(gòu)可能與模板分子差異較大,但是可能有著相同的體外活性及作用機制。此在一定程度上完善了基于MIT的藥物篩選理論。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S859.5
【部分圖文】：

圖 2.2 FT-IR 光譜圖（a. 酸洗活化的硅膠，b. KH570@硅膠，c. OSMIP@硅膠，d. NIP@硅膠）Figure 2.2 FT-IR spectra(a. activated silica gel, b. KH570@silica gel, c. MIP@silica gel, d. NIP@silica gel).別是酸洗活化的硅膠（a），KH570@硅膠（b），OSMIP@硅膠（c）和 NIP@圖中位于 3440 cm-1、1630 cm-1和 1110 cm-1處的吸收峰是硅膠中 Si-O-H 的70 cm-1處的吸收峰主要是 Si–O 振動（Chrzanowska et al, 2015; Sarkar et al, 中位于 1720 cm-1處的吸收峰則主要是因為 C=O 的彈性振動，其主要是由 2.1）對硅膠進行衍生化（KH570@硅膠）以后引入羰基造成的，以及聚修飾后，交聯(lián)劑 EGDMA（結(jié)構(gòu)見圖 2.1）中的羰基也被引入而造成的。另酸洗活化硅膠的紅外光譜與其他三者之間存在明顯差別，說明對硅膠完成飾；而圖 2.2b、c 和 d 中吸收峰和強度間的差別不大，說明 KH570@硅膠硅膠三者具有類似的骨架。分析

(c1) (c2)圖 2.3 掃描電鏡圖（a. OSMIP@硅膠，b. NIP@硅膠，c. KH570@硅膠）Figure 2.3 SEM images(a. OSMIP@silica gel, b NIP@silica gel, c KH570@silica gel)2.3.4 多孔性分析多孔性硅膠微球擁有巨大的比表面積。在本部分試驗中所購買多孔性硅膠微球，其粒徑為 5μm，標(biāo)示的比表面積為 400 m2g-1。因此，多孔性硅膠微球的表面經(jīng)常被用作分子印跡的基質(zhì)。委托中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所工程中心，采用氮氣吸附孔隙度測定法檢測了 OSMIP@硅膠和 NIP@硅膠的比表面積，采用 Brunauer - Emmett - Teller (BET)方法計算了比表面積，采用 Barret- Joyner - Halenda (BJH)法計算了孔體積和平均孔徑等，結(jié)果見表 2.2。

科學(xué)院博士學(xué)位論文 第四章 OSMIP@硅膠的吸附特異性1）計算了 OSMIP@硅膠對 OS 的吸附量。法，檢測 NIP@硅膠對 OS，以及 OSMIP@硅膠對帕拉米韋、鹽酸小檗堿、甲氧芐啶吸附量。附熱力學(xué)試驗照上述方法，分別在 15 ℃、25 ℃、35 ℃和 45 ℃的條件下，開展靜態(tài)吸附試驗。果與討論量檢測方法的建立1）LC-MS/MS 檢測條件的確定考之前的研究工作，以及相關(guān)文獻，在 Scan 模式下確定各化合物的母離子，在 Podu確定各化合物的特征子離子，并優(yōu)化 MRM 檢測參數(shù)。、帕拉米韋、鹽酸小檗堿堿和甲氧芐啶的母離子、子離子掃描圖見圖 4.2 至 4.5。
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1 楊亞軍;OSMIP@硅膠的制備及其篩選神經(jīng)氨酸酶抑制劑先導(dǎo)化合物的機制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

本文編號：2852245