空腸彎曲桿菌(Camplylobacter jejuni)是全球范圍內(nèi)引起人和動物食源性腹瀉的主要病原菌,有研究發(fā)現(xiàn),C.jejuni的發(fā)病機制與鞭毛在宿主上皮細胞的定植力、黏附、侵襲力以及毒素的產(chǎn)生密切相關(guān)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在紅霉素誘導(dǎo)的耐藥空腸彎曲桿菌中cj0440c出現(xiàn)上調(diào)表達;在C.jejuni NCTC11168中,cj0440c基因缺失突變后,該菌的鞭毛出現(xiàn)斷裂,且鞭毛相關(guān)基因出現(xiàn)差異表達。cj0440c基因?qū)Ρ廾木唧w調(diào)控機制尚不清楚,NCBI上注釋該基因為假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子,但尚未有研究發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)哪些基因的表達。有研究表明,Cj0440c的同源蛋白TenA(兩者同源性為30.7%)為一個硫胺素酶,能參與到硫胺素的合成代謝,猜測Cj0440c也可能具有硫胺素酶的作用。為了研究cj0440c基因的功能,本研究通過觀察在不同藥物處理下菌株中cj0440c與鞭毛相關(guān)基因的表達量,分析cj0440c與各鞭毛基因之間的關(guān)系;在大腸桿菌里重組表達Cj0440c蛋白,通過酶解實驗驗證Cj0440c蛋白是否參與硫胺素的代謝途徑;構(gòu)建空腸彎曲桿菌過表達載體,嘗試利用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法體內(nèi)篩選Cj0440c直接調(diào)控的目的基因;通過凝膠阻滯實驗體外驗證Cj0440c蛋白與前期基因芯片結(jié)果中cj0440c缺失突變后差異表達的九個鞭毛相關(guān)基因之間的相互作用。測定彎曲桿菌對九種藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素、慶大霉素、依替米星、四環(huán)素、替加環(huán)素、恩諾沙星、加替沙星)的MIC以及MPC,確定各種藥物的選擇突變窗(MSW),篩選出1/2MPC藥物濃度的耐藥菌,分析cj0440c以及鞭毛相關(guān)基因的表達量。結(jié)果顯示,在NCTC11168的耐藥菌株中,除了替加環(huán)素耐藥菌中cj0440c下調(diào)表達外,其他藥物的耐藥菌中cj0440c均上調(diào)表達。在紅霉素誘導(dǎo)的耐藥菌中cj0440c上調(diào)表達,cj1338c也上調(diào)表達,與前期研究中,紅霉素耐藥菌株cj0440c缺失突變后,cj1338c下調(diào)表達結(jié)果相符。在所選的兩種氨基糖苷類藥物以及兩種四環(huán)素類藥物的耐藥菌中,其他四個基因的表達趨勢與cj0440c一致。而在所選的兩種氟喹諾酮類藥物中,cj0440c上調(diào)表達,cj1338c和cj1339c均下調(diào)表達,cj0043和cj0697均上調(diào)表達。在ATCC33559的耐藥菌株中,除了在紅霉素、阿奇霉素、慶大霉素這三種藥物的耐藥菌中cj0440c上調(diào)表達,在其他藥物的耐藥菌中均下調(diào)表達。在紅霉素和慶大霉素的耐藥菌中cj0440c以及其他的鞭毛基因均上調(diào)表達。當cj0440c出現(xiàn)下調(diào)表達時,這四個鞭毛基因中至少會有一個基因出現(xiàn)下調(diào)表達。反向證明cj0440c能夠引起鞭毛相關(guān)基因的差異表達。利用pET28a構(gòu)建含有cj0440c基因的原核表達重組載體P-440,并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達,采用抗His標簽的抗體通過Western-blot來驗證表達的融合蛋白,并通過Ni-NTA親和層析得到純化的Cj0440c。以硫胺素為底物,通過觀察Cj0440c能否催化硫胺素的降解產(chǎn)生4-甲基-5-羥乙基噻唑和4-氨基-5-羥基甲基-2-甲基嘧啶來驗證該蛋白是否具有硫胺素酶的功能。結(jié)果表明,反應(yīng)后的體系中并未發(fā)現(xiàn)硫胺素的分解產(chǎn)物。利用大腸桿菌DH5α-空腸彎曲桿菌穿梭載體pRY112構(gòu)建含有cj0440c的表達載體,用于在C.jejuni中進行染色質(zhì)免疫共沉淀從體內(nèi)篩選Cj0440c的調(diào)控基因。過表達載體構(gòu)建成功后,嘗試自然轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化以及接合轉(zhuǎn)移的方式將載體轉(zhuǎn)入到空腸彎曲桿菌中,但均未成功,最終改為體外的方式驗證Cj0440c對目的基因的調(diào)控作用。根據(jù)實驗室前期研究,挑選出cj0440c缺失突變菌株中九個差異表達的基因(cj1026c(假定脂蛋白)、cj1729c(鞭毛鉤蛋白FlgE)、cj1466(鞭毛鉤相關(guān)蛋白FlgK)、cj0687c(鞭毛基體L環(huán)FlgH)、cj0697(鞭毛基體棒蛋白FlgG2)、cj0698(鞭毛基體棒蛋白FlgG)、cj1632c(假定的周質(zhì)蛋白)、cj1339c(鞭毛蛋白FlgA)以及cj1462(鞭毛基體P環(huán)FlgI))進行凝膠阻滯實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cj0440c蛋白不能直接與上述九個基因的啟動子片段相結(jié)合。綜上所述,在九種藥物誘導(dǎo)的耐藥菌株中,cj0440c與各鞭毛相關(guān)基因都出現(xiàn)差異表達,且表達量與紅霉素耐藥菌株中的表達量以及cj0440c缺失突變菌株中差異表達量相符。當cj0440c下調(diào)表達時,所選的四個鞭毛相關(guān)基因中至少會有一個基因下調(diào)表達,間接驗證了cj0440c能夠參與到鞭毛的合成代謝。本研究成功表達Cj0440c蛋白,硫胺素酶解實驗驗證該基因并不具有硫胺素酶的作用。凝膠阻滯實驗中,Cj0440c蛋白并不能直接與cj1026c、cj1729c、cj1466、cj0687c、cj0697、cj0698、cj1632c、cj1339c以及cj1462這九個基因的啟動子區(qū)域相結(jié)合,推斷出可能Cj0440c并不能直接調(diào)控這些鞭毛基因的表達。本課題的研究有助于了解cj0440c與空腸彎曲桿菌鞭毛相關(guān)基因間的相互作用,對完善空腸彎曲桿菌鞭毛合成調(diào)控機制具有參考意義。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

空腸彎曲桿菌假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 Cj0440c 對鞭毛合成調(diào)控機制的初步研究2.5 cj0440c 原核表達載體的構(gòu)建2.5.1 載體構(gòu)建方案以空腸彎曲桿菌 NCTC11168 的基因組為模板，PCR 擴增出兩端含有酶切位點(BamH I 和 Xho I)的 cj0440c 片段，純化回收后通過 TA 克隆連接到克隆載體 pMD19-T simple 上，構(gòu)建克隆載體 T-440。T-440 經(jīng) BamH I 和 Xho I 雙酶切后得到具有黏性末端的 cj0440c 片段，用同樣的限制性內(nèi)切酶來雙酶切表達載體 pET28a，利用 T4 連接酶將具有相同黏性末端的cj0440c片段和 pET28a連接到一起構(gòu)建重組表達載體P-440。載體構(gòu)建方案如圖 1 所示。

圖 2 載體 pRY112Fig. 2 Plasmid pRY112加 His 標簽的 cj0440c 以及啟動子 cmeABC 連接到表達載體 pRY112c 在空腸彎曲桿菌中過表達，并利用 His 標簽的抗體來做后續(xù)的 ChiBC 啟動子以及帶有 His 標簽 cj0440c1 的 PCR 引物如表 18 所示。表 18 cmeABC、Cj0440c1 PCR 擴增引物序列Table 18 The primers for cmeABC and Cj0440c1 PCR amplification序列 GGACTAGTTAAATGGAATCAATAGCTCCAAAGC CGAGCTCCAGGGTAAGTAAAACTAAGTGGTAA CGAGCTCATGcaccaccaccaccaccacATGCTTTTCTCTAATTTAATCA TCCCCGCGGTTAAAGATTTAATTCCATTCTTAAAGAA

空腸彎曲桿菌假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 Cj0440c 對鞭毛合成調(diào)控機制的初步研究結(jié)果與分析 彎曲桿菌的生長曲線、MIC、MPC 以及 MSW 測定結(jié)果在 42℃，5%CO2，10%O2的條件下將空腸彎曲桿菌 NCTC11168 和結(jié)腸彎曲桿ATCC33359 在 MH 肉湯中培養(yǎng)至第三代時，取培養(yǎng)不同時間點的菌液，測定其00值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，測定的 OD600值為縱坐標，繪制生長曲線。如圖 3 所示，空腸彎曲桿菌較其他菌株生長較為緩慢，NCTC11168 約 16h 時進長對數(shù)期，在 24 h 時 OD600可以達到 0.6，30 h 后才進入生長穩(wěn)定期。對于C33559 比 NCTC11168 相對較快一點，12 h 時進入生長對數(shù)期，在 20 h 時 OD60達到 0.6，26 h 后進入生長穩(wěn)定期。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 任方哲;王楠;商宇偉;焦新安;黃金林;;空腸彎曲菌鞭毛研究進展[J];中國人獸共患病學報;2013年08期

2 曾縣平;;細菌鞭毛系統(tǒng)的研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2012年27期

3 惠星星;李燁;王小元;;空腸彎曲菌flhA突變株的構(gòu)建及其功能研究[J];食品與生物技術(shù)學報;2011年03期

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1 郝海紅;彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥發(fā)生與適應(yīng)性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

本文編號：2852066