發(fā)布時間：2020-10-22 20:08

　　 仙臺病毒(Sendai virus, SeV)屬副黏病毒科,副黏病毒屬,為單股負(fù)鏈RNA病毒。SeV唯一的自然宿主是嚙齒類動物,SeV為清潔級和SPF(Specific pathogen free, SPF)級實驗小鼠的必須檢測項目。小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)是冠狀病毒科,冠狀病毒屬的正鏈RNA病毒,基因組不分節(jié)段。MHV是清潔級小鼠必檢項目。呼腸孤病毒3型(Reovirus type 3, Reo-3)屬于呼腸孤病毒科,正呼腸孤病毒屬,是雙股RNA病毒。Reo-3為SPF級實驗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠的必檢項目。實驗動物一旦上述感染病毒,將干擾實驗結(jié)果,影響科學(xué)研究的準(zhǔn)確性。目前,實驗室診斷主要運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等血清學(xué)方法,也可通過病毒分離方法檢測。ELISA測抗體是檢測病毒最常用的方法,但抗體在感染1-2周后才能出現(xiàn),因此ELISA不適合感染早期的診斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)和RT-PCR是重要的分子生物學(xué)檢測方法,具有簡便快速的特點,已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)、寄生蟲學(xué)檢測中。Luminex液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的新型檢測技術(shù),它集合了激光技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)以及微球數(shù)字信號處理技術(shù)。與傳統(tǒng)的臨床檢測方法相比,其主要優(yōu)點在于高通量、高敏感、重復(fù)性高、檢測范圍廣、反應(yīng)速度快,僅需微量樣品即可進(jìn)行檢測等。Luminex具有兩大核心技術(shù)：xMAP(?)技術(shù)和xTAG(?)技術(shù)。xMAP(?)技術(shù)檢測原理為抗原-抗體反應(yīng),可用于蛋白質(zhì)和核酸的檢測；xTAG(?)技術(shù)能夠測定若干基因組形式,如基因表達(dá)分析,微RNA分析,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析,特定序列的檢測等。目的：為建立一種能快速檢測小鼠SeV、MHV、Reo-3等3種病毒的方法。方法：聯(lián)合使用RT-PCR技術(shù)和Luminex液相基因芯片技術(shù),針對SeV、MHV、Reo-3的保守區(qū)域分別設(shè)計引物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得大小為263bp、152bp和180bp的目的片段；對引物進(jìn)行修飾,上游引物分別連接一段特定的TAG序列(與微球上的anti-TAG反向互補),下游引物用生物素標(biāo)記。利用修飾過的引物重新進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),產(chǎn)物與微球進(jìn)行雜交,建立小鼠3種病毒的液相基因芯片方法；并評價該方法的特異性、靈敏度。分別利用Luminex液相基因芯片和ELISA對送檢小鼠進(jìn)行檢測,對比兩種方法的檢出率。結(jié)果：建立的液相基因芯片檢測方法能快速檢測小鼠SeV、MHV、Reo-3等3種病毒,且該方法方便快速、特異性好、靈敏度高,病毒檢出率優(yōu)于ELISA。結(jié)論：成功建立了小鼠3種病毒的液相芯片檢測方法。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

得出如下結(jié)論；在敏感性方面，通過１０倍連續(xù)稀釋ＨｅＶ的模板ＲＮ種方法的檢測敏感性相當(dāng)；在準(zhǔn)確性方面，Ｌｕｍｉｎｅｘ液相忘片更占優(yōu)勢，液相的區(qū)分陰性結(jié)果和陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，誤判率低，如３號馬在感染后２、４和５ｄ液相芯片的方法檢測出ＨｅＶ陽性，而巧光定量ＰＣＲ的判定結(jié)果為陰性或不確定ｎｅｘ液相芯片技術(shù)的應(yīng)用??ｉｎｅｘ具有兩大核屯、技術(shù)；ｘＭＡＰ？技術(shù)和ｘＴＡＧ？技術(shù)。ｘＭＡＰ？技術(shù)利用特定的染些微球上偶聯(lián)有針對不同待測物的抗體或者探針，ｘＭＡＰ？技術(shù)可用于蛋白質(zhì)和。ｘＴＡＧ？技術(shù)則使用Ｌｕｍｉｎｅｘ專有的ＴＡＧ標(biāo)簽序列，通過ＴＡＧ序列與微球上序列的互補配對雜交，從而實現(xiàn)樣本序列同微球的雜交而不需要單獨設(shè)計探針。??術(shù)能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標(biāo)記的微球之間因此，ｘＴＡＧ？技術(shù)具有ｘＭＡＰ？技術(shù)的優(yōu)勢，但應(yīng)用相對局限，主要應(yīng)用在多重檢測方面。??巧?核酸鑒定？

Ｆｉｇ３?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｘＴＡＧ??４．小結(jié)與展望??在實驗動物血清學(xué)檢測方面，尤其是小鼠、地鼠等體型較小的實驗動物，可采集分離??出的血清數(shù)量少，不能滿足常規(guī)檢測方法對多種病原微生物的檢測所需血清的量。而??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片僅需要少量的樣本即可同時對多種病原微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片技術(shù)具有高通量、高精確性的特點，可應(yīng)用于多個指標(biāo)聯(lián)合檢測，在臨??床上已廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測、自身免疫性疾病早期診斷及遺傳性疾病的基因診斷??等方面。當(dāng)然其技術(shù)尚有一些問題需要進(jìn)一步解決，比如：Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片不能連續(xù)對??待測樣品的濃度進(jìn)行監(jiān)測；不能監(jiān)測樣品祀序列與微球上探針的結(jié)合情況；此外Ｌｕｍｉｎｅｘ??系統(tǒng)是一個開放平臺，ＰＣＲ產(chǎn)物和所用化學(xué)試劑存在污染實驗室的可能Ｗ７＾。??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片在蛋白質(zhì)檢測方面，ＣＲＬ進(jìn)行了深入研究，研制出多通路免疫巧光??檢測方法ＭＦＩＡ的相關(guān)產(chǎn)品，用于大小鼠、豚鼠、兔等實驗動物質(zhì)量控制，對感染早期敏??

對引物進(jìn)行在線Ｂｌａｓｔ，查看特異性（引物的Ｓｔａｎｄａｒｄ?Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ＢＬＡＳＴ詳見附錄１）??通過使用單一病毒ｃＤＮＡ與ＳｅＶ、ＭＨＶ、Ｒｅｏ－３等Ｈ種病毒的引物分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒??應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ＰＣ民檢測中，未檢測出非特異性產(chǎn)物。結(jié)果如圖５顯示；１－３孔是Ｗ?ＳｅＶ??為模板的ＲＴ－ＰＣ民結(jié)果；４－６孔是Ｗ?ＭＨＶ為模板的ＲＴ－ＰＣ艮結(jié)果；７－９孔為Ｗ?Ｒｅｏ－３為模??板的民Ｔ－ＰＣ民結(jié)果。??４００?郵—ＷｔｅｆｇＢＢｉｎ—盈裝化??３００ｂｐ?．．ｉ：由�。�?Ｉｉ葡：專；甫避離；繼－電??圖５：引物特異化結(jié)果??Ｆｉｇ５?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｏｆ?Ｐｒｉｍｅｒ??３．４測序結(jié)果??�。确N病毒的ＰＣ民產(chǎn)物非Ｌ，用濃度為３％的瓊脂糖凝膠電泳，選擇有條帶的、片段??
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本文編號：2852042