奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)是乳蛋白和乳脂肪合成的基本單元,在乳腺泌乳調(diào)控過(guò)程中,BMECs的增殖、凋亡和自噬均與乳合成相關(guān),但其詳細(xì)機(jī)理仍有待深入研究。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果表明,甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)調(diào)節(jié)BMECs乳合成功能,GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式與其下游蛋白核轉(zhuǎn)錄因子κB1(NFκB1)和m~6A甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3)結(jié)合,進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游靶蛋白mTOR進(jìn)而促進(jìn)乳合成,研究表明mTOR與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān),但以上三種蛋白是否調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬揭示GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3是否調(diào)節(jié)BMECs自噬。前期研究結(jié)果表明,p-GlyRS可以激活NFκB1生成p-NFκB1,進(jìn)一步擬揭示p-GlyRS是否使METTL3磷酸化從而激活METTL3的分子機(jī)理,本研究將有利于揭示乳蛋白、乳脂肪調(diào)控的分子機(jī)理,為牛乳合成調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。本研究利用組織塊法獲取純化的BMECs,免疫熒光染色法結(jié)合Western blot鑒定BMECs中CK18(Cytokeratin 18)及β-酪蛋白(β-casein)的表達(dá)以鑒定細(xì)胞純度。分別轉(zhuǎn)染si-GlyRS、si-METTL3、si-NFκB1以及轉(zhuǎn)染NFκB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及添加海藻糖(Tre)自噬增強(qiáng)劑及蛋氨酸(Met),Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記性蛋白LC3-II表達(dá)量;以上各處理組同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-C-EGFP-LC3B質(zhì)粒,利用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞自噬斑點(diǎn)(LC3-II)變化。利用免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)結(jié)合Western blot檢測(cè)p-GlyRS與METTL3是否存在相互作用。原核誘導(dǎo)表達(dá)并純化GST-METTL3,將其作為底物與通過(guò)Co-IP收集到的p-GlyRS進(jìn)行激酶反應(yīng)。將pCMV-C-Flag-GlyRS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,提純胞核蛋白,利用Flag純化試劑盒并結(jié)合磷酸化試劑盒進(jìn)行純化,獲得純化的p-GlyRS蛋白,和原核表達(dá)的GST-GlyRS分別與GST-METTL3進(jìn)行體外激酶反應(yīng),鑒定是否有磷酸化的METTL3蛋白生成。Western blot與免疫熒光染色檢測(cè)表明,干擾GlyRS基因,抑制p-mTOR表達(dá),促進(jìn)BMECs自噬;添加Tre與Met并干擾GlyRS基因表達(dá),抑制BMECs自噬。干擾NFκB1基因,正向調(diào)控BMECs自噬;過(guò)表達(dá)NFκB1與添加Tre同時(shí)處理后,NFκB1過(guò)表達(dá)能夠減輕Tre誘導(dǎo)的自噬。干擾METTL3基因,抑制p-mTOR表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞自噬。以上結(jié)果表明GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3抑制BMECs發(fā)生自噬。體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)Co-IP收集到的p-GlyRS和提純胞核蛋白的p-GlyRS均使METTL3磷酸化。檢測(cè)GST-GlyRS與GST-METTL3反應(yīng)組顯示GST-GlyRS不能激活METTL3。本實(shí)驗(yàn)獲得以下結(jié)論,G1yRS通過(guò)介導(dǎo)Met調(diào)控mTOR信號(hào)通路,抑制BMECs自噬。METTL3通過(guò)mTOR信號(hào)途徑抑制BMECs自噬,NFκB1抑制BMECs自噬。體外激酶活性分析表明,Co-IP得到p-GlyRS與純化的胞核蛋白p-GlyRS均使METTL3磷酸化。本研究結(jié)果為揭示GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3調(diào)節(jié)BMECs自噬提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);也為揭示p-GlyRS調(diào)節(jié)METTL3的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S823
【部分圖文】：

組織塊培養(yǎng) 10d，組織塊周?chē)屑?xì)胞爬出；B：BMECs 與成纖維細(xì)胞混合C：純化的 BMECs；D：純化的成纖維細(xì)胞。 began to grow from mammary tissue after 10 days; B: Mixed growth of BMECcells; C: Purified epithelial cells; D: Purified fibroblasts.圖 3-1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純化. 3-1 Primary culture and purification of bovine mammary epithelial

：藍(lán)色為 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，綠色為 Alexa Fluor 488 標(biāo)記的 CK18；B：藍(lán)色為 DAPI 標(biāo)胞核，紅色為 Alexa Fluor 647 標(biāo)記的β-casein。 A: DAPI-labeled nuclei (blue), Alexa Fluor 488-labeled CK 18 (green); B: DAPI-labeled nucleAlexa Fluor 647-labeled β-casein (red).圖 3-2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 CK18 和β-casein 的鑒定Fig. 3-2 Detection of CK18 and β-casein in BMECs

rn blot 檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中 CK18 和 of expression of CK18 and CSN2 in BMEC達(dá)對(duì) BMECs 自噬的影響P-LC3B 真核表達(dá)載體構(gòu)建鑒定 RNA 純度結(jié)果如 3-4 所示，說(shuō)明在提在目的位置處有明顯的單一條帶，表明擴(kuò)目的基因片段和真核表達(dá)載體 pGCMV-IR例進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞粒，再進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果所示。序，確定無(wú)堿基突變及缺失后，凍存菌種
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2848950