天祝白牦牛因其被毛純白而具有較高的利用價值,除生產(chǎn)肉、絨、毛、奶等產(chǎn)品外,也被當(dāng)作高原地區(qū)景觀動物,被毛長短是影響其景觀價值的重要因素之一。本研究通過2b-RAD測序,利用一般線性模型和混合線性模型進行全基因組關(guān)聯(lián)分析,篩選與白牦牛被毛長短相關(guān)的多態(tài)位點和候選基因,并采用實時熒光定量PCR技術(shù)對候選基因進行了驗證,旨在尋找影響白牦牛被毛長短的分子標記,為長毛型白牦牛的選育提供一定的理論依據(jù)。現(xiàn)得到如下結(jié)果:1.對60頭天祝白牦牛個體進行2b-RAD測序,根據(jù)完整性80%,最小等位基因頻率(MAF)0.01為標準進行過濾,獲得78732個多態(tài)性標記。2.通過全基因組關(guān)聯(lián)分析,獲得了43個顯著相關(guān)SNP位點和8個候選基因:位于2號染色體上的FER基因,位于6號染色體上的DKK1基因,位于7號染色上的MST1基因,位于12號染色體上的ZFP36L1基因和PDGFD基因,位于24號染色體上的FGF5基因和LEF1基因,以及位于26號染色體上的BMP6基因。3.實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),在正常個體中皮膚組織中,FGF5基因和DKK1基因表達量極顯著高于長毛型個體(P0.01),BMP6基因表達量顯著低于長毛型個體(P0.05)。LEF1、FER、MST1、ZFP36L1和PDGFD基因表達量差異不顯著(P0.05)。
【學(xué)位單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S823.85
【部分圖文】：

第二章 材料與方法2.1 材料2.1.1 試驗樣品試驗選取的 60 頭白牦牛來自甘肅省武威市天祝藏族自治縣松山鎮(zhèn)黑馬圈河，由天�？h牦牛繁育場提供。白牦牛年齡為 2-3 歲，飼養(yǎng)條件相同，健康狀況良好，樣本采集時間一致。主要采集對象毛長差異明顯的牦牛（如圖 2-1），表型數(shù)據(jù)見附錄�，F(xiàn)場使用抗凝管采集血樣，立即送回試驗室進行基因組 DNA 的提取。同時在長毛組和正常組中各選取三頭牦牛，分別采取體側(cè)皮膚組織，清洗后放入事先備好 RNAlater 的凍存管中，投入液氮罐帶回試驗室進行皮膚組織 RNA 的提取。

圖 2-2 2b-RAD 建庫測序流程Fig.2-2 The test process of 2b-RAD2.2.3.2 信息分析流程利用電子酶切從牦牛參考基因組中提取含有酶切識別位點的標簽，作為參考序列；利用 SOAP[105]軟件（version2.21）將測序數(shù)據(jù)比對到參考序列上，利用最大似然法（ML）[106]對多態(tài)性位點進行分型。基于上述分析所得，進行生物信息學(xué)分析，主要為全基因組關(guān)聯(lián)分析。具體分析流程如下（圖 2-3）：(1) 數(shù)據(jù)過濾：為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準確性，將 Raw Reads 進行過濾；(2) Enzyme Reads 提取：提取含有酶切識別位點的 Reads（Enzyme Reads）用于后續(xù)分析；(3) 數(shù)據(jù)比對：利用 SOAP 軟件將 Enzyme Reads 比對到構(gòu)建好的參考序列上；(4) SNP 分型：根據(jù)比對結(jié)果，利用最大似然法（ML）進行分型；(5) SNP 注釋：使用 SnpEff 軟件對得到的 SNP 進行注釋，以確定 SNP 在基因元件的位置、對氨基酸的變化影響。

圖 2-3 2b-RAD 生物信息學(xué)分析流程圖Fig.2-3 The main protocol of bioinformatics analysis2.2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析對樣本進行測序分析后，確定本研究最終獲得的總標簽數(shù)目、樣品測序深度Unique 標簽數(shù)目及 SNP 標記數(shù)目。對獲得的遺傳信息進行 SNP 注釋，進行目標性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，研究顯著相關(guān)的 SNP 位點，挖掘影響不同白牦牛個體間被毛長短差異形成的功能基因。通過基于兩種不同的算法的統(tǒng)計軟件 EMMAX 和 PLINK 分別進行 GWAS先用一般線性模型進行分析（GLM），發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)的位點，再采用混合線性模型（MLM）對目標性狀進行關(guān)聯(lián)分析。以群體遺傳結(jié)構(gòu)為固定效應(yīng)，個體親緣關(guān)系為隨機效應(yīng)，以校正群體結(jié)構(gòu)和個體親緣關(guān)系的影響。關(guān)聯(lián)分析的模型為：= a + bx + g + e，（式中 Y 代表性狀表型值；a 代表性狀平均值；b 代表候選基因型和加性效應(yīng)；x 代表基因型矢量值（0，1，2），g 代表親緣關(guān)系效應(yīng)，e 代表隨
【參考文獻】

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本文編號：2849514