肌內(nèi)脂肪(IMF)沉積是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,單獨(dú)研究一個(gè)基因?qū)MF含量(大理石花紋)的影響收效甚微,因此本研究選取同一遺傳背景和飼養(yǎng)管理,背最長(zhǎng)肌IMF含量極端差異的兩組復(fù)州牛x利木贊x和牛雜交牛(crossbreed of Fuzhou Yellow ctle×Limousine×Wagyu,FLW)牛,利用二代測(cè)序技術(shù)篩選影響IMF沉積的差異基因、SNV和新轉(zhuǎn)錄本,并分析牛的解藕聯(lián)蛋白3(uncoupling protein3,UCP3)和甲狀腺激素應(yīng)答蛋白(Thyroid Hormone Responsive Spot14protein, THRSP)基因內(nèi)含子上SNP與FLW牛大理石花紋性狀的相關(guān)性,旨在為闡明IMF沉積相關(guān)分子機(jī)理以及進(jìn)一步篩選IMF沉積有效的分子標(biāo)記提供理論依據(jù)。 通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,共發(fā)現(xiàn)749個(gè)在兩組中差異表達(dá)的基因(FC≥2,P≤0.05),其中在大理石花紋等級(jí)高的FLW牛(Y2)中高表達(dá)的基因共366個(gè),低表達(dá)的基因共383個(gè)。對(duì)749個(gè)差異基因進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)在David數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋了696個(gè)基因,富集于956個(gè)Category,根據(jù)Category功能的相關(guān)性進(jìn)行聚類,共聚類145個(gè)Cluster,其中8個(gè)Clusters與脂肪和脂肪酸的消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程有關(guān),去除重復(fù)基因后8個(gè)Cluster有48個(gè)差異基因。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析,有兩條與脂肪代謝相關(guān)的通路被富集,分別為MAPK信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路。經(jīng)熒光定量PCR驗(yàn)證,8個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)與RNA-Seq結(jié)果一致,說(shuō)明RNA-Seq結(jié)果可靠。 進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行深入分析發(fā)現(xiàn),21個(gè)與脂肪代謝相關(guān)的差異基因,其中PPARGCiA和PPARGC1B基因,與PPAR信號(hào)通路相關(guān)的SLC27Al和SLC27At基因在Y2中高表達(dá)。其它一系列基因(SCD.ABHD5.PRKAG2.GADD4G(?)HRSP)也在Y2中高表達(dá)。9個(gè)與脂肪代謝相關(guān)的基因(APOM、APOL3、APOAl、APOE(?)FOXC2基因)在Y2中低表達(dá)。在果糖和甘露糖代謝通路中,FBPl、HK2和TSTA3基因在Y1中高表達(dá),而PFKFB2和PFKFB3卻在Y2中高表達(dá)。與成纖維相關(guān)的基因12個(gè),TGF-β111、TGF-βIGFBP6FGFR-4在大理石花紋等級(jí)低的FLW牛(Y1)中高表達(dá)。同時(shí),與降低纖維沉積相關(guān)的DKK1基因以及COL11A2和COL22A1,在Y2中高表達(dá)。MPPl9.COL14A1、COL16A10、COL1A1.COL1A2以及TGA8、ITGB4、ITGBL1除了ITGB6.)基因,它們的表達(dá)量也在Y1中上調(diào)。與成肌相關(guān)的基因6個(gè),MyoD、Myog、Myf6、MYl3、Myl6B和MYL9基因在Y1中高表達(dá)。 利用第一代測(cè)序,分析差異基因UCP3和THRSP內(nèi)含子上SNP位點(diǎn),并將其與FLW牛大理石花紋等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)UCP3第五內(nèi)含子5個(gè)SNP位點(diǎn)中,C786G和C782G位點(diǎn)CG型個(gè)體脂色等級(jí)和脂肪含量顯著高于CC型個(gè)體(P0.05)。A559G位點(diǎn)AG型個(gè)體脂色等級(jí)和脂肪含量顯著高于AA型個(gè)體(P0.05)；G457T位點(diǎn)GT型個(gè)體相關(guān)性狀(眼肌肉長(zhǎng)、三角牛腩等級(jí)、背膘脂肪厚、脂色等級(jí)、肉色等級(jí)、大理石花紋等級(jí))顯著高于GG型個(gè)體(P0.05)；同時(shí)以上位點(diǎn)純合型個(gè)體鮮肉水分含量顯著高于雜合型個(gè)體(P0.05)。THRSP內(nèi)含子存在的6個(gè)SNP位點(diǎn),T448C雜合TC型個(gè)體大理石花紋等級(jí)顯著高于TT型個(gè)體(P0.05),其余5個(gè)位點(diǎn)與FLW牛大理石花紋等性狀均未達(dá)到顯著差異。 本研究利用高通量測(cè)序?qū)ε＜∪廪D(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,篩選出一系列與IMF沉積相關(guān)的基因、SNP和新基因,為進(jìn)一步研究IMF沉積提供了基礎(chǔ),同時(shí)也為利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育生產(chǎn)大理石花紋肉的新牛種提供了寶貴數(shù)據(jù)依據(jù)。此外,UCP3和THRSP基因內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)的與大理石花紋等性狀有顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),為UCP3和THRSP:基因在肉牛育種工作中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S823
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
英文縮略詞
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 前言
    2 IMF的組成與分布
    3 IMF的沉積
        3.1 IMF的合成
        3.2 IMF的分解
        3.3 IMF代謝的調(diào)節(jié)
    4 IMF沉積的分子基礎(chǔ)
    5 IMF與牛肉品質(zhì)的關(guān)系
    6 影響IMF的候選基因研究
    7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)
        7.1 RNA-Seq原理
        7.2 RNA-Seq應(yīng)用
    8 研究意義
    9 技術(shù)路線
第二部分 FLW牛不同大理石花紋等級(jí)肌肉轉(zhuǎn)錄組分析
    第一章 FLW牛不同大理石花紋等級(jí)肌肉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 試驗(yàn)動(dòng)物屠宰、分割及取樣
            2.3 RNA—Seq測(cè)序設(shè)備
            2.4 主要試劑及溶液
            2.5 總RNA的提取及質(zhì)檢方法
            2.6 測(cè)序cDNA文庫(kù)構(gòu)建
            2.7 mRNA-Seq文庫(kù)質(zhì)檢
            2.8 上機(jī)mRNA-Seq和原始數(shù)據(jù)預(yù)處理
            2.9 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析流程
            2.10 差異基因熒光定量PCR驗(yàn)證
        3 結(jié)果與分析
            3.1 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
            3.2 轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量信息統(tǒng)計(jì)
            3.3 Reads統(tǒng)計(jì)及與基因組mapping結(jié)果統(tǒng)計(jì)
            3.4 牛肌肉表達(dá)基因分析
            3.5 差異基因篩選與聚類分析
            3.6 差異基因功能分析
            3.7 牛肌肉轉(zhuǎn)錄組SNV分析
            3.8 新基因預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)
            3.9 差異基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR
        4 討論與結(jié)論
    第二章 比較不同大理石花紋等級(jí)牛肉中成脂、成纖維、成肌因子的研究
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品準(zhǔn)備
            2.2 RNA提取和RNA-Seq
            2.3 數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 成脂基因的表達(dá)
            3.2 成纖維基因的表達(dá)
            3.3 成肌基因的表達(dá)
        4 討論
            4.1 牛背最長(zhǎng)肌中成脂分子的表達(dá)和脂肪代謝
            4.2 牛背最長(zhǎng)肌中成纖維相關(guān)分子的調(diào)節(jié)
            4.3 牛背最長(zhǎng)肌中成肌因子的調(diào)節(jié)
        5 結(jié)論
第三部分 FLW牛大理石花紋相關(guān)基因基因型與表現(xiàn)型關(guān)聯(lián)分析
    第一章 UCP3基因第五內(nèi)含子多態(tài)性與FLW牛肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物信息及樣本收集
            2.2 屠宰性狀與相關(guān)肉質(zhì)性狀測(cè)定紀(jì)錄
        3 DNA測(cè)序分析UCP3基因型
            3.1 儀器設(shè)備
            3.2 溶液配制方法
            3.3 DNA的提取
            3.4 引物設(shè)計(jì)與合成
            3.5 PCR擴(kuò)增UCP3基因部分片段
            3.6 測(cè)序UCP3基因部分片段
            3.7 主要分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件
        4 統(tǒng)計(jì)與分析
            4.1 基因頻率和基因型頻率的計(jì)算
            4.2 多態(tài)信息含量(PIC)
            4.3 有效等位基因數(shù)(Ne)
            4.4 群體雜合度(He)
            4.5 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)
            4.6 統(tǒng)計(jì)分析模型
        5 結(jié)果
            5.1 IMF含量結(jié)果
            5.2 基因組DNA提取結(jié)果
            5.3 UCP3基因DNA部分片段擴(kuò)增結(jié)果鑒定
            5.4 UCP3基因SNPs位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果
            5.5 UCP3基因多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳分析
            5.6 UCP3基因多態(tài)性與FLW群體的胴體肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析
        6 討論
    第二章 THRSP基因內(nèi)含子多態(tài)性與FLW牛肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物信息及樣本收集
            2.2 屠宰性狀與相關(guān)肉質(zhì)性狀測(cè)定紀(jì)錄
        3 DNA測(cè)序分析THRSP基因型
            3.1 儀器設(shè)備
            3.2 溶液配制方法
            3.3 DNA的提取
            3.4 引物設(shè)計(jì)與合成
            3.5 PCR擴(kuò)增THRSP基因部分片段
            3.6 測(cè)序THRSP基因部分片段
            3.7 主要分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件
        4 統(tǒng)計(jì)與分析
        5 結(jié)果
            5.1 屠宰性狀和相關(guān)肉質(zhì)性狀、基因組DNA提取結(jié)果
            5.2 THRSP基因DNA部分片段擴(kuò)增結(jié)果鑒定
            5.4 THRSP基因SNPs位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果
            5.5 THRSP基因多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳分析
            5.6 THRSP基因多態(tài)性與FLW牛群體的胴體肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析
        6 討論
第四部分 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
個(gè)人簡(jiǎn)介

【參考文獻(xiàn)】

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1 祝洪生;陳睿;曾怡;蘇勝?gòu)?李齊發(fā);張翔;李二林;方威;謝莊;;朗德鵝THRSPα基因PCR-SSCP分析及與產(chǎn)肝性能的相關(guān)性[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2009年04期

2 張小白;昝林森;王洪寶;郝瑞杰;楊彥杰;;五個(gè)牛品種THRSP基因257C/G突變的遺傳多態(tài)性研究[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2009年05期

3 任亮;朱寶芹;韓丹;張軼博;宋惠娟;曾瑞霞;蘇玉虹;;豬UCP3基因多態(tài)性及其與脂肪沉積、肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2006年05期

本文編號(hào)：2848907