委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis,VEE)是由委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus,VEEV)引起的高致病性人獸共患傳染病,馬屬動(dòng)物是VEEV的擴(kuò)增宿主。人經(jīng)蚊蟲叮咬感染VEEV后,主要呈現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)炎及腦炎等臨床癥狀。VEEV于1938年在病馬中首次分離得到,隨后研究證明,VEEV可通過氣溶膠進(jìn)行傳播,易感性高,是潛在的危險(xiǎn)生物戰(zhàn)劑。因此,美國(guó)NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)和CDC(Centers for Disease Control)將VEEV列為B類病原體。迄今,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)獲批的人用VEE疫苗以及有效治療藥物。我國(guó)尚無(wú)VEE病例的相關(guān)報(bào)道,但經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的全球化大大地增加了VEEV傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,出入境口岸必須加強(qiáng)對(duì)VEEV的檢測(cè),以確保從根源上阻斷VEEV的傳入。綜上所述,我國(guó)急需建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便的VEEV抗原、抗體檢測(cè)方法。為此,本研究選用VEEV TRD強(qiáng)毒株基因序列,建立VEEV間接ELISA抗體檢測(cè)方法、VEEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法及基于VEEV假病毒的中和抗體檢測(cè)方法,以期為VEE疫情監(jiān)測(cè)和VEEV抗原、抗體檢測(cè)提供技術(shù)支持。1.委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VEEV E2蛋白胞外區(qū)(tE2),優(yōu)化誘導(dǎo)條件后,純化目的蛋白tE2;利用純化的tE2作為包被抗原建立VEEV間接ELISA抗體檢測(cè)方法,并對(duì)該方法的工作條件進(jìn)行優(yōu)化,隨后對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià),檢測(cè)其特異性、重復(fù)性和敏感性。結(jié)果顯示,通過PCR擴(kuò)增的方法,凝膠電泳可見大小約為1023 bp的tE2基因片段,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)-VEEV-tE2,經(jīng)鑒定,tE2主要以包涵體形式存在,且在37℃、0.6mM IPTG誘導(dǎo)3 h條件下tE2表達(dá)量最高;純化的tE2經(jīng)薄層掃描純度可達(dá)94%。以純化的VEEV tE2為包被抗原,建立VEEV間接ELISA抗體檢測(cè)方法,優(yōu)化后的工作條件:抗原最佳包被濃度為10μg/m L,4℃孵育過夜;封閉液Super Blocking Buffer 37℃封閉1.5 h;待檢測(cè)血清1:40稀釋,37℃孵育1.5 h;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體1:10000稀釋,37℃孵育1 h。建立的VEEV間接ELISA抗體檢測(cè)方法可特異性識(shí)別VEEV陽(yáng)性抗體;批間與批內(nèi)變異系數(shù)均小于8%,重復(fù)性良好。綜上所述,成功建立簡(jiǎn)便、快速、高通量的VEEV間接ELISA抗體檢測(cè)方法。2.委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒假病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用構(gòu)建包含VEEV E3-E2-6K-E1(E_(123))的真核表達(dá)質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pNL4-3.Luc.RE共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48h后收獲假病毒;利用電鏡及Western Blot鑒定假病毒,對(duì)假病毒進(jìn)行易感細(xì)胞的篩選后,進(jìn)行假病毒感染力的測(cè)定;利用VEEV假病毒建立中和抗體檢測(cè)方法,對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建pCAGG-VEEV-E_(123)并與pNL4-3.Luc.RE共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收獲假病毒上清pVEEV-E_(123)。經(jīng)Western Blot鑒定,p VEEV-E_(123)泳道可見42 kD的VEEV E2蛋白條帶和24 kD的HIV-1 P24蛋白條帶,透射電鏡下pVEEV-E_(123)上清中可觀察到與HIV大小相近的假病毒粒子。將pVEEV-E_(123)感染NA、Huh-7、BSR、BHK-21和Vero E6細(xì)胞,結(jié)果表明pVEEV-E_(123)對(duì)Huh-7細(xì)胞感染力最強(qiáng)。故基于pVEEV-E_(123)建立了VEEV中和抗體檢測(cè)方法,該方法可特異性檢測(cè)VEEV中和抗體,重復(fù)性良好。該方法可用于血清樣品的中和抗體檢測(cè)。綜上所述,成功地建立了VEEV假病毒系統(tǒng),并將其應(yīng)用于VEEV中和抗體的檢測(cè),降低了VEEV研究中操作活毒的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。3.委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),制備表達(dá)VEEV t E2的重組桿狀病毒rpFBD-2tE2。將純化的tE2免疫家兔,制備兔源多克隆抗體;選用VEEV單克隆抗體作為捕獲抗體、兔源多克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立可定量檢測(cè)rpFBD-2tE2及VEEV-V5(表達(dá)C-E3-E2-6K-E1的重組桿狀病毒)中E2蛋白含量的VEEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法;對(duì)該方法工作條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其敏感性、特異性、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,捕獲抗體的最佳包被濃度為8μg/m L,檢測(cè)抗體的最佳稀釋度為1:1600,檢測(cè)限為8.619 ng/m L。該方法可特異性檢測(cè)出VEEV重組桿狀病毒rpFBD-2tE2及VEEV-V5,與其他病毒樣顆粒上清不發(fā)生反應(yīng),且批間及批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。利用該方法測(cè)得重組桿狀病毒rpFBD-2tE2中E2蛋白的相對(duì)含量在739.89~1025.17 ng/m L,VEEV-V5中E2蛋白含量在10.68~38.90 ng/m L。綜上所述,成功地建立了VEEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法;該方法可用于VEE亞單位疫苗中E2蛋白含量的檢測(cè),為疫苗的評(píng)價(jià)及疫情監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。綜上所述,本研究建立了三種快速、簡(jiǎn)便的VEEV檢測(cè)方法,為VEE疫情監(jiān)測(cè)、新型疫苗的抗原定量以及免疫效果評(píng)價(jià)等奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

arker DL2000 1. VEEV tE2 基因1.1 PCR 擴(kuò)增 VEEV tE2 基因電泳phoretic profile of PCR product of構(gòu)建及鑒定pET-30a(+)片段進(jìn)行連接，連CR 鑒定，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠 GenBank 中收錄的基因序列

arker DL2000 1. VEEV tE2 基因 1.1 PCR 擴(kuò)增 VEEV tE2 基因電泳rophoretic profile of PCR product of 的構(gòu)建及鑒定 pET-30a(+)片段進(jìn)行連接，連 PCR 鑒定，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠與 GenBank 中收錄的基因序列

導(dǎo)的空載體 2. IPTG 誘導(dǎo) 3 h 空載體 誘導(dǎo) 3 h 重組菌圖 1.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的 Western Bl.3 SDS-PAGE profile of expressed target 導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化的優(yōu)化G 分別誘導(dǎo) 1、2、3、4、5、6、7、顯，本著“節(jié)約成本”的原則，確定
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曹增國(guó);王化磊;王麗娜;楊松濤;夏咸柱;;委內(nèi)瑞拉馬腦炎疫苗研究進(jìn)展[J];傳染病信息;2015年02期

2 千莎莎;何彪;涂忠忠;郭煥成;涂長(zhǎng)春;;委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒一步法熒光定量RT-PCR方法的建立[J];病毒學(xué)報(bào);2015年02期

3 李云云;郭萬(wàn)柱;;乙型腦炎新型疫苗的研究進(jìn)展[J];當(dāng)代畜牧;2014年15期

4 李琳;郭彥;趙光宇;于虹;孫世惠;潘婷;唐健;周育森;樊衛(wèi)平;;中東呼吸綜合征冠狀病毒假病毒系統(tǒng)的建立及其在中和抗體檢測(cè)中的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2014年02期

5 夏咸柱;;關(guān)口前移,從源頭防控人獸共患病[J];獸醫(yī)導(dǎo)刊;2012年09期

6 Maria Trovato;Shelly J Krebs;Nancy L Haigwood;Piergiuseppe De Berardinis;;Delivery strategies for novel vaccine formulations[J];World Journal of Virology;2012年01期

7 王振東;王林林;楊宇;楊永莉;王靜;;委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒重組抗原的制備純化及其膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)生物工程雜志;2011年07期

8 姜濤;鄧永強(qiáng);于曼;陳水平;秦成峰;秦鄂德;;3種重要腦炎病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2007年03期

9 鄧永強(qiáng);姜濤;于曼;陳水平;秦成峰;劉伯華;祝慶余;秦鄂德;;實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)感染小鼠不同組織標(biāo)本中的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2006年11期

10 龐樂君;張新民;;委內(nèi)瑞拉馬腦炎[J];傳染病信息;2004年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 王琪;馬爾堡病毒抗原、抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 張金勇;基孔肯雅病毒E1重組腺病毒候選疫苗的構(gòu)建鑒定、免疫評(píng)價(jià)及免疫動(dòng)物體內(nèi)殘留檢測(cè)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 曹增國(guó);西尼羅病毒快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：2847975