單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria mnocytogenes,Lm)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,Li)作為李斯特菌屬中唯一致病的兩個(gè)種深受研究者的關(guān)注,其中Li主要感染羊、牛等反芻動(dòng)物,極少引起人類的感染和發(fā)病;而Lm除感染動(dòng)物外還能感染人類,引起人侵襲性和胃腸炎性李斯特菌病。Lm是兼性胞內(nèi)寄生的病原體,能侵襲宿主的多種細(xì)胞(包括吞噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)進(jìn)行增殖,并擴(kuò)散到毗鄰的細(xì)胞中。Lm能夠突破宿主的三道屏障(胃腸道、胎盤和血腦屏障),引起的李斯特菌病致死率約為20-30%。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70多種毒力因子參與該病原菌的粘附、侵入和胞內(nèi)增殖,但其與宿主互作與致病的分子機(jī)制尚未完全闡明,有待通過(guò)高通量的組學(xué)技術(shù)進(jìn)行深入研究。本研究在前期對(duì)強(qiáng)毒株Lm XYSN全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上,對(duì)Lm XYSN中新發(fā)現(xiàn)的伊氏李斯特菌來(lái)源的基因smcL及其功能進(jìn)行研究,并初步探討了其表達(dá)產(chǎn)物與李斯特菌溶血素O(listeriolysionO,LLO)之間的關(guān)系;此外,還利用動(dòng)物模型從LmXYSN的轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)中篩選出與Lm XYSN的高致病力相關(guān)的新毒力因子。Lm XYSN中的毒力相關(guān)基因的挖掘及功能解析,有助于揭示該菌株高毒力的分子致病機(jī)制,為李斯特菌病的預(yù)防和控制提供科學(xué)的依據(jù)。1、自然重組單核細(xì)胞增生李斯特菌中smcL基因的功能研究將Lm XYSN smcL的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)smcL的基因和與Li來(lái)源的基因序列同源性為97%,而迄今為止未見(jiàn)Lm中攜帶smcL基因的報(bào)道,因此這是首次在Lm中發(fā)現(xiàn)smcL基因。smcL基因編碼的鞘磷脂酶C(SmcL)能特異性地作用于鞘磷脂,且具有一定的溶血活性,為L(zhǎng)i的重要毒力因子,由此提示,SmcL蛋白的表達(dá)很可能在增強(qiáng)LmXYSN毒力中發(fā)揮重要作用。為了深入研究Li來(lái)源的smcL基因的功能,成功構(gòu)建了Lm XYSN △hly、LmXYSN△smcL、Lm XYSN Ahly-AsmcL缺失突變株,以及能表達(dá)SmcL蛋白的Lm EGDe::pIMK2-smcL 和Lm NTSN::pIMK2-smcL菌株。與馬紅球菌(Rhodococcus equi,R.equi)的協(xié)同溶血試驗(yàn)表明,只有當(dāng)Lm中smcL基因得到表達(dá)時(shí),才會(huì)與R.equi形成鏟形的溶血現(xiàn)象。通過(guò)測(cè)定突變株和重組菌株的溶血效價(jià),發(fā)現(xiàn)smcL基因的缺失會(huì)導(dǎo)致LmXYSN溶血能力下降2倍,而其在Lm EGDe中的表達(dá),則使重組菌株的溶血能力提高了 4倍,提示smcL基因顯著增強(qiáng)了 Lm XYSN的溶血能力,很有可能有利于其在體內(nèi)的感染和致病。對(duì)結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞系Caco-2 BBE進(jìn)行的體外感染試驗(yàn)顯示,smcL基因能顯著提高Lm對(duì)該細(xì)胞系的粘附、侵襲和增殖能力。接下來(lái)以口服感染動(dòng)物模型對(duì)smcL基因的功能進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,在感染72h以后,smcL和hly基因雙缺失的突變株與hly基因單缺失的菌株相比,其在腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟中的定殖能力顯著降低(P0.01,P0.05,P0.05)。非常重要的是,smcL基因在NTSN中的重組表達(dá)顯著增強(qiáng)了其在回腸和腸系膜淋巴結(jié)中的定殖能力(P0.01,P0.001)。總之,以上結(jié)果證明smcL基因作為L(zhǎng)m的獨(dú)有基因,對(duì)其宿主體內(nèi)的生存和內(nèi)臟組織中的定殖中發(fā)揮重要作用,因此該基因是XYSN毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵毒力因子之一。2、基于轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)技術(shù)篩選的李斯特菌新毒力基因LMxysn_0620的功能研究以BALB/c小鼠口服感染動(dòng)物模型,篩選Lm XYSN的轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)。從突變文庫(kù)中隨機(jī)挑取500個(gè)突變菌株進(jìn)行口服感染實(shí)驗(yàn),最后獲得13株毒力下降100倍以上的突變株。通過(guò)反向PCR和基因測(cè)序后的比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)7株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)(xysn_1358、xysn_1979、n2165、xysn_2795、xysn_1812、sysn_2865、xysn_2030),3個(gè)基因分別與DNA的轉(zhuǎn)錄(xysn_0972)、蛋白質(zhì)的修飾(xysn_1491、xysn_1284)相關(guān),還有2個(gè)基因的功能是未知的(xysn_2490、xysn_0620)。利用小鼠口服感染突變株來(lái)測(cè)定 LD50,xysn_0620::Tn 的毒力(LDs0=107.85CFU)比Lm XYSN(LD50=105.08CFU)降低了 588倍,表明xysn_0620參與Lm XYSN感染小鼠的過(guò)程。構(gòu)建xysn_0620基因的缺失突變株Lm XYSN △0620,對(duì)Lm XYSN △0620在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失突變株與親本株在BHI培養(yǎng)基和在含有1%Triton的BHI培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率并無(wú)差異。在不同培養(yǎng)時(shí)間和溫度下,對(duì)缺失株和野生株的生物被膜形成能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,LmXYSN△0620在42℃形成生物被膜的能力均顯著下降(P0.05,P0.01)。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)xysn_0620基因缺失使細(xì)菌對(duì)克林霉素(Clindamycin,DA)的抗性由耐受變?yōu)橹卸让舾�。以上結(jié)果提示,具有跨膜結(jié)構(gòu)的xysn_0620基因編碼產(chǎn)物可能為L(zhǎng)m XYSN的細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分。此外,體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),xysn_0620基因的缺失會(huì)引起Lm XYSN對(duì)Caco-2BBE細(xì)胞黏附、侵襲、增殖的能力均顯著性降低(P0.01,P0.05,P0.01)。最后對(duì)LmXYSN△0620缺失株在體內(nèi)的感染動(dòng)態(tài)進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)Lm XYSN △0620在小鼠脾臟中定殖的時(shí)間晚于野生菌株,在感染后的48h和72h,在脾臟中的定殖能力(P0.01,P0.001)和肝臟中的定殖能力(P0.05,P0.001)顯著弱于野生菌株,提示其在脾臟和肝臟中的定殖能力顯著弱于野生菌株�？傊�,XYSN_0620作為一跨膜蛋白,在Lm抗脅迫應(yīng)答及對(duì)宿主內(nèi)的侵襲、定植等致病過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

霉素和高溫（４２°Ｃ）雙重壓力下進(jìn)行傳代，經(jīng)ＰＣＲ鑒定后挑取重組菌株于雙抗性ＢＨ［液??體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以脫去抗性質(zhì)粒。以ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙＷ２為外圍引物，ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２為內(nèi)側(cè)引物，??鑒定ＺｗＸＹＳＮ的／＾基因是否缺失，結(jié)果如圖１－３和１－４所示。將擴(kuò)增出的ＰＣＲ產(chǎn)物送??至南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果正確表明已成功構(gòu)建出ＸＹＳＮ??缺失株。??３０００＾４＇?－?７；＾３３９〇ｂｐ??％?２２５０ｂｐ＜?￣??：?崎一?＿?——＞１８〇７ｂＰ??：，６〇ｂｐ??ｍｕ??圖１－３?Ｉｍ?ＸＹＳＮ?Ａ／？（ｙ鑒定結(jié)果?圖１－４?ＸＹＳＮ?ＡＷ；；鑒定結(jié)果??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｉＬｍ?ＸＹＳＮ?Ａｈｌｙ?Ｆｉｇ．?１－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆＺｗ?ＸＹＳＮ?Ａｂｌｙ??Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ??Ｋ?２，?３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２?１、２、３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙ＼Ｖ２??同理，利用引物ｓｍｃｌＰｌ、ｓｍｃｌＰ２、ｓｍｃｌＰ３、ｓｍｃｌＰ４擴(kuò)增出規(guī)ｃＬ基因的上游片段ｓｍｃｌＦｌ，??和基因下游片段ｓｍｃｌＦ２

霉素和高溫（４２°Ｃ）雙重壓力下進(jìn)行傳代，經(jīng)ＰＣＲ鑒定后挑取重組菌株于雙抗性ＢＨ［液??體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以脫去抗性質(zhì)粒。以ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙＷ２為外圍引物，ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２為內(nèi)側(cè)引物，??鑒定ＺｗＸＹＳＮ的／＾基因是否缺失，結(jié)果如圖１－３和１－４所示。將擴(kuò)增出的ＰＣＲ產(chǎn)物送??至南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果正確表明已成功構(gòu)建出ＸＹＳＮ??缺失株。??３０００＾４＇?－?７；＾３３９〇ｂｐ??％?２２５０ｂｐ＜?￣??：?崎一?＿?——＞１８〇７ｂＰ??：，６〇ｂｐ??ｍｕ??圖１－３?Ｉｍ?ＸＹＳＮ?Ａ／？（ｙ鑒定結(jié)果?圖１－４?ＸＹＳＮ?ＡＷ；；鑒定結(jié)果??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｉＬｍ?ＸＹＳＮ?Ａｈｌｙ?Ｆｉｇ．?１－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆＺｗ?ＸＹＳＮ?Ａｂｌｙ??Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ??Ｋ?２，?３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２?１、２、３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙ＼Ｖ２??同理，利用引物ｓｍｃｌＰｌ、ｓｍｃｌＰ２、ｓｍｃｌＰ３、ｓｍｃｌＰ４擴(kuò)增出規(guī)ｃＬ基因的上游片段ｓｍｃｌＦｌ，??和基因下游片段ｓｍｃｌＦ２

以ｓｍｄＷｌ／ｓｍｃｌＷ２為外圍引物，ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２為內(nèi)側(cè)引物，鑒定Ｌｍ?ＸＹＳＮ和Ｌｍ??ＸＹＳＮＡ／ｚ／＿ｙ中的ｓｍｃＺ基因是否缺失，結(jié)果如圖１－６和１－７所示。將擴(kuò)増出的ＰＣＲ產(chǎn)物送??至南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果正確表明己成功構(gòu)建出ＸＹＳＮ??Ｌｗ?ＸＹＳＮ?Ａ／ｚ／ｙ－ＡｓｗｃＺ?缺失株。??ｂｐ?ＸＹＳＮ?（１８０９ｂｐ）?Ｘ＼＇ＳＮＡｓｍｃｉ＜８０１＾）?ＸＴＳＸＡ＾ｍｒ／ＡＭＫＳＯｌｂｐ）??麟??圖１－６外圍引物ＰＣＲ鑒定ｓｍｃｌ缺失株結(jié)果??Ｆｉｇ．?１－６?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｍｃＬ?ｍｕｔａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ｓｍｃｌＷｌ／ｓｍｃｌＷ２??ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ：?ＤＬ２０００??戀??圖１－７內(nèi)圍引物ＰＣＲ鑒定ｗＬ缺失株結(jié)果??１０Ｑ０?？?Ｆｉｇ．?１－７?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｍｃＬ?ｍｕｔａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２??ｉ?＇?Ｐ?Ｍ：ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ??２５〇?１，?２，?３，?４，?５：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２??２．３重組表達(dá)ＳｍｃＬ菌株的構(gòu)建??提�。蹋�?ＸＹＳＮ的基因組并作為模板，利用ｐＩＭＫ２Ｐｌ／ｐＩＭＫ２Ｐ２擴(kuò)增出ｓｍｃＬ片段。利??用重組酶試劑ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓＴＭ?ＩＩ?Ｏｎｅ?Ｓｔｅｐ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｋｉｔ，將訓(xùn)。／／與線性化的ｐＩＭＫ２連接起??來(lái)。將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)至大腸桿菌ＤＨ５ａ中。對(duì)長(zhǎng)出的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ鑒定
【參考文獻(xiàn)】

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1 陳永輝,史賢明;利用轉(zhuǎn)座子Tn917構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成突變株[J];微生物學(xué)報(bào);2005年06期

本文編號(hào)：2847703