豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)在世界范圍內(nèi)普遍流行,它是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙、斷奶仔豬呼吸道癥狀、生長(zhǎng)遲緩以及高死亡率為特征的一種急性、高度傳染的病毒性疾病。由PRRSV誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的體外研究需要豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和與免疫細(xì)胞的相互作用。然而,已有的永生化PAM細(xì)胞不允許PRRSV感染。從豬原代PAM(pPAM)分離的豬CD163受體可賦予PRRSV對(duì)非易感細(xì)胞的感染性,從而建立新的細(xì)胞系以更方便地研究PRRSV感染動(dòng)力學(xué)及其誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制。本研究以pPAM擴(kuò)增CD163基因,利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)將其插入到永生化PAM細(xì)胞的染色體中,使其隨細(xì)胞增殖而穩(wěn)定表達(dá)。試驗(yàn)鑒定顯示,用高致病性(Highly Pathogenic)HP-PRRSV毒株JXA1感染mPAM-CD163細(xì)胞,能產(chǎn)生高于10~9 copies/mL滴度的子代病毒;該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定傳代至少100代。此外,我們還研究了接種不同毒力PRRSV的mPAM-CD163和pPAM中的相關(guān)細(xì)胞因子和Toll-like receptors(TLR)的表達(dá)狀況。mPAM-CD163細(xì)胞系與pPAM細(xì)胞相比顯示了極其相似的病毒復(fù)制和細(xì)胞因子分泌規(guī)律。因此,本研究建立的穩(wěn)定的表達(dá)CD163的PAM細(xì)胞系可替代原代PAM細(xì)胞用于體外實(shí)驗(yàn),研究細(xì)胞因子分泌機(jī)制和PRRSV感染的PAM細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用。從4-6周齡的PRRSV、PCV2雙陰性仔豬肺中獲取pPAM細(xì)胞,按照豬CD163的基因序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR方法擴(kuò)增豬CD163基因。將擴(kuò)增的CD163基因片段連接到克隆載體pEASY-T1,構(gòu)建克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CD163。用限制性內(nèi)切酶Xba I和Xho I分別雙酶切pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro,從載體質(zhì)粒pEASY-T1-CD163上將CD163基因克隆至慢病毒基因過(guò)表達(dá)載體pLV-sf GFP(2A)Puro中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109中,陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定命名為pLV-EGFP-CD163。將無(wú)內(nèi)毒素pLV-EGFP-CD163質(zhì)粒加入到293T細(xì)胞中培養(yǎng),收集培養(yǎng)液得到病毒顆粒。經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選出適合永生化PAM細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳濃度后,在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中加入慢病毒顆粒進(jìn)行感染,得到含有目的基因的細(xì)胞群細(xì)胞。將細(xì)胞群細(xì)胞稀釋后接種到96孔板培養(yǎng),采用有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。將篩選到的穩(wěn)定表達(dá)CD163的單克隆細(xì)胞株命名為mPAM-CD163。該細(xì)胞系經(jīng)過(guò)Western blot試驗(yàn),結(jié)果顯示mPAM-CD163細(xì)胞中CD163蛋白得到了正確的表達(dá),分子量約為130 KDa。抗體阻斷試驗(yàn)表明,抗CD163抗體與CD163結(jié)合后,與對(duì)照組相比PRRSV滴度以劑量依賴性方式減少。共聚焦結(jié)果顯示,CD163蛋白主要定位在細(xì)胞的胞膜。此外,該細(xì)胞系允許PRRSV感染并且產(chǎn)生超過(guò)10~9copies/mL高滴度的子代病毒,該細(xì)胞系能夠至少傳代100代。用HP-PRRSV JXA1毒株和經(jīng)典SD1株感染該細(xì)胞系,產(chǎn)生的病毒粒子數(shù)雖然低于pPAM,但是其變化趨勢(shì)與pPAM相似。用不同毒力的高致病性PRRSV JXA1毒株與經(jīng)典PRRSV SD1毒株感染pPAM和mPAM-CD163細(xì)胞,熒光定量PCR方法測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ)和Toll受體(TLR-3、TLR-7)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的細(xì)胞系與pPAM細(xì)胞在細(xì)胞因子方面有幾乎相同的變化規(guī)律,其中,在24 hpi IL-4和6、12 hpi IL-10的mRNA和上清水平與原代細(xì)胞的分泌不同;在Toll樣受體mRNA表達(dá)的變化規(guī)律是一致的。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

與輔助亞基一起，這些酶組裝成膜相關(guān)的病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（Pedersen et al.,999），其介導(dǎo)基因組復(fù)制和嵌套的亞基因組 mRNA 的合成。.2.3 PRRSV 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白ORF2-5 編碼糖基化膜蛋白 GP2-GP5，ORF6 編碼非糖基化膜蛋白（M），ORF7 編核衣殼蛋白（N）（Snijder and Meulenberg, 1998；Dea et al., 2000）（圖 2）。其中 GP2白是由兩個(gè)囊膜糖基化蛋白 GP2a 和 GP2b 組成的（Wu et al., 2001），所有的結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)感染性至關(guān)重要（Molenkamp et al., 2000；Wissink et al., 2005）。GP5 和 M 是 PRRSV膜的主要組成成分，它們?cè)诓《局幸黄饦?gòu)成形成二硫鍵連接的異二聚體（Dea et al.,000；Mardassi et al., 1996）。有研究表明：從 PRRSV 感染性克隆中刪除這兩個(gè)中的任個(gè)蛋白都會(huì)導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生病毒顆粒，而次要包膜蛋白的缺失對(duì)病毒顆粒的產(chǎn)生沒(méi)有影（Wissink et al., 2005）。

圖 3 PRRSV 細(xì)胞受體（Zhang and Yoo, 2015）Fig.3 cellular receptors for PRRSV1.4.2 病毒侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程吸附、侵入、脫殼、病毒成分的合成、病毒粒子的裝配和釋放等步驟是病毒侵染細(xì)胞的生命周期。對(duì)于無(wú)囊膜病毒而言，吞飲是主要途徑，在網(wǎng)格蛋白的作用下宿主細(xì)胞膜內(nèi)陷進(jìn)而使病毒進(jìn)入被感染的細(xì)胞；對(duì)于有囊膜的病毒來(lái)說(shuō)，病毒與胞膜融合過(guò)程包括了吸附、侵入、脫殼的過(guò)程，這是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程。決定感染成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是病毒的吸附過(guò)程。需要病毒表面特異性的吸附蛋白與細(xì)胞表面受體（病毒受體）相互作用。大部分動(dòng)物病毒的病毒受體是鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的糖蛋白，另外也有糖脂或唾液酸寡糖苷。在 0-37℃內(nèi)溫度越高病毒吸附細(xì)胞表面受體效率也就越高，在幾分鐘到幾十分鐘時(shí)間內(nèi)整個(gè)過(guò)程即可完成。病毒的細(xì)

ISPR/Cas9 技術(shù)，導(dǎo)致生產(chǎn)了編碼 SRCR5外顯子 7缺失的SRCR5 的缺失對(duì)正常飼養(yǎng)條件下的豬在生長(zhǎng)率和完整從動(dòng)物中分離 PAM 和外周血單核細(xì)胞（PBMC），并SF1 刺激細(xì)胞顯示相應(yīng)來(lái)源的巨噬細(xì)胞的特征性分化和失 SRCR5 的 CD163 在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)和正確折疊除劑的蛋白質(zhì)的生物活性。種紅細(xì)胞結(jié)合因子，通過(guò)與結(jié)構(gòu)域 SRCR2 和表達(dá) CD1除衰老和畸形的成紅細(xì)胞，從而增強(qiáng)未成熟成紅血細(xì)胞RCR3 作為血紅蛋白（Hb）-觸珠蛋白（Hp）清道夫受紅蛋白具有氧化性和毒性；一旦與 Hp 結(jié)合，其通過(guò)與并隨后被內(nèi)吞而被清除。這可以防止氧化損傷，保持體（Burkard et al., 2017b）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王曉佳,張衛(wèi)紅,汪明,高福;囊膜病毒膜融合的分子機(jī)制[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2004年06期

本文編號(hào)：2847051