豬流感是由豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。豬流感病毒亞型眾多,變異速度快,廣泛流行于包括我國在內(nèi)的世界各地養(yǎng)殖場豬群中,給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前疫苗接種仍是防控豬流感的最有效手段。在保證疫苗安全性的前提下,為了提高豬流感疫苗的保護效果,本研究分別制備了表達SIV血凝素(HA)基因的活病毒載體疫苗r SMX?TK?g I/g E-opti HA和利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達并純化的HA蛋白制備的亞單位疫苗,并對兩者的單獨及聯(lián)合免疫效果進行初步研究。通過將兩種疫苗單獨或配合使用,測定各組體液免疫和細胞免疫水平、攻毒后的病理損傷情況、體重丟失以及存活率等方面來比較不同免疫策略下保護效果的差異,以期找到免疫效果最佳的疫苗組合,為豬流感疫苗的研發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。本研究主要內(nèi)容如下:1.表達SIV HA基因的重組變異偽狂犬病病毒r PRV-HA的制備本研究以變異偽狂犬病病毒基因缺失毒株(r SMX?g I/g E?TK)為載體,以密碼子優(yōu)化的H1N1亞型豬流感病毒HA基因為目的基因,采用同源重組的方法,成功構(gòu)建了重組病毒r SMX?TK?g I/g E-opti HA,并對獲得的重組病毒在多種細胞上的增殖特性、一步生長曲線、遺傳穩(wěn)定性以及對小鼠的安全性等生物學(xué)特性進行了研究。結(jié)果表明,r SMX?TK?g I/g E-opti HA能夠穩(wěn)定表達HA蛋白。該重組病毒在ST、PK-15、Vero和BHK-21細胞上的毒價均高于107.0 TCID50/0.1 m L,并且在PK-15細胞上的毒價達108.0 TCID50/0.1 m L。一步生長曲線結(jié)果表明,該重組病毒的增殖特性與親本毒株一致。連續(xù)傳代20代后,HA基因未發(fā)生變異,表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性,并且對小鼠安全性良好。2.HA蛋白亞單位疫苗的制備本研究采用經(jīng)典的Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達系統(tǒng),表達HA蛋白。將SIV HA基因的信號肽及胞外域片段克隆到轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac HT B中,獲取重組質(zhì)粒p Fast Bac HT B-HA。將鑒定正確的重組質(zhì)粒p Fast Bac HT B-HA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中,經(jīng)三次藍白斑篩選得到含HA基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒r Bacmid-HA。隨后,將重組桿粒r Bacmid-HA轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細胞中,獲得重組桿狀病毒r Ac MNPV-HA,傳代3次后,用sf9細胞進行重組蛋白的優(yōu)化表達。SDS-PAGE和Wstern blotting結(jié)果顯示,重組蛋白在培養(yǎng)上清和細胞內(nèi)均表達,且培養(yǎng)上清中的蛋白,即分泌蛋白均以糖基化形式存在;而在細胞內(nèi)表達的蛋白多以非糖基化形式存在。3.兩種豬流感基因工程疫苗單獨及聯(lián)合免疫效果研究在成功制備了活病毒載體疫苗r SMX?g I/g E?TK-opti HA和HA蛋白亞單位疫苗的基礎(chǔ)上,本研究將4周齡健康雌性BLAB/c小鼠隨機分為8組,其中3個實驗組和5個對照組,每組10只,空白對照組(非免疫不攻毒)每組5只。采取皮下注射的免疫方式進行r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒載體疫苗的單獨免疫、HA蛋白亞單位疫苗的單獨免疫以及r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒載體疫苗和HA蛋白亞單位疫苗的聯(lián)合免疫,同時設(shè)置親本病毒載體對照組,DMEM對照組、佐劑對照組、滅活疫苗對照組以及空白對照組(詳細分組見表3-6)。每組共免疫2次,間隔4周。分別在首免后第0、2、4和6周采血檢測SIV ELISA抗體、PRV ELISA抗體、SIV HI抗體以及細胞因子IFN-γ,并于加強免疫2周后,在乙醚麻醉下,用H1N1(F9)(LD50為102.38 TCID50)通過滴鼻方式進行攻毒,劑量為50ul/只。攻毒后連續(xù)14 d每日稱量每只小鼠的體重,并觀察小鼠臨床表現(xiàn)及統(tǒng)計死亡情況。結(jié)果顯示,r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒載體疫苗單獨免疫、HA蛋白亞單位疫苗的單獨免疫以及兩種疫苗聯(lián)合免疫均能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答及細胞免疫應(yīng)答;r SMX?TK?g I/g E-opti HA的單獨免疫效果最佳但低于SIV滅活疫苗對照組。攻毒保護力試驗結(jié)果表明,兩種疫苗單獨及聯(lián)合免疫對小鼠均有較好的保護力,保護率分別為85.7%、85.7%和71.4%,PBS對照組存活率僅42.9%。r SMX?TK?g I/g E-opti HA的單獨免疫與兩種疫苗聯(lián)合免疫保護力相當(dāng),且高于HA亞單位疫苗的單獨免疫。因此,從本研究結(jié)果可以初步判定r SMX?TK?g I/g E-opti HA單獨免疫具有最佳的免疫保護效果。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.52
【部分圖文】：

圖 3-2 重組病毒 rSMX TK gI/gE-optiHA 的構(gòu)建示意圖Figure. 3-2 The construction of rSMX TK gI/gE-optiHA3.2.2.2 重組病毒 rSMX gI/gE TK-optiHA 的 Western Blotting 和 IFA 鑒定SDS-PAGE 與 Western blotting：(1) 蛋 白 樣 品 的 制 備 ： 將 親 本 株 rSMX TK gI/gE 及 重 組 病 毒rSMX TK gI/gE-optiHA 株分別接種 PK-15 細胞，待細胞全部病變時，分別收集細胞和上清，上清先 4 5000 r/min 離心 5-10 min 去除脫落的細胞，再 12000 r/mi離心 1 min 去除細胞碎片等雜質(zhì)，最后加入 PEG8000 使終濃度為 10%，放在 4 過夜進行蛋白濃縮，次日 12000 r/min 離心 30min，小心棄去上清，加入適量 PBS 重懸即得到濃縮上清樣品。向六孔板孔中加入 PBS 清洗細胞 2-3 次，細胞刮刀刮取細胞4 離心 5 min，棄上清，按比例加入蛋白裂解液(含 PMSF)，4 或冰上裂解 30 min4 12000 r/min 離心 5-10 min，取上清即得到細胞裂解上清樣品。分別各取 80 μ濃縮上清樣品和細胞裂解上清樣品，加入 20 μL5×SDS Loading Buffer，用注射器或移液器吹打至不再粘稠，沸水煮樣 10 min，冰浴 5 min 后，12000 r/min 離心甩下沉

兩種 H1N1 亞型豬流感基因工程疫苗的制備及免疫效果評價4 結(jié)果與分析4.1 HA 基因的生物信息學(xué)分析經(jīng)預(yù)測，SIV HA 蛋白第 1-17 氨基酸為信號肽區(qū)域（圖 4-1A），第 543-566 氨基酸為跨膜區(qū)（圖 4-1B）。武瑞靜的研究表明流感病毒可以通過自身的血凝素蛋白信號肽實現(xiàn)分泌表達(武瑞靜 2012)，所以本研究選用了自身的信號肽，并參考Masaru Kanekiyo 等的實驗設(shè)計將表達區(qū)域確定為 HA 去除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的 HA1和 HA2 基因（1-518 氨基酸）。經(jīng)預(yù)測，目的蛋白的大小約 58 kD，等電點為 6.74（圖 4-1C）。

gI/gE-optiHA 的構(gòu)建及鑒定SMX TK gI/gE-EGFP 和 rSMX TK gI/gE-oEGFP質(zhì)粒與rSMX gI/gE TK基因組采用常程中未采集圖片），然后用轉(zhuǎn)染液進行空斑過 5 輪純化后，獲得純化好的重組病毒 rS重組病毒 rSMX TK gI/gE-EGFP 構(gòu)建完成瓶傳代 3 次，每代次都進行熒光觀察，沒有提基因組，準備下一輪轉(zhuǎn)染，用目的基因把 圖 4-2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig. 4-2 PCR identification of transfer plasmA:PCR identification of pcaggs-LR-EGFPB:PCR identification of pcaggs-LR-optiHAM:DL15 000 DNA Marker；Lane 1-4: Recombinant plaLane 5:Negative control
【參考文獻】

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本文編號：2843710