發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 20:52

　　 禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的可以發(fā)生高度接觸性傳染病。目前發(fā)現(xiàn)HA共有18種亞型(H1-H18),NA共有11種亞型(N1-N11),HA和NA亞型的組合形成不同亞型的禽流感病毒。根據(jù)對(duì)動(dòng)物的致病性強(qiáng)弱,禽流感被分為三種,分別是高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HP-AI)、中等致病性禽流感(Mildly Pathogenic Avian Influenza,MP-AI)和低致病性禽流感(Lowly Pathogenic Avian Influenza,LP-AI)。我國(guó)的第一例H9N2亞型禽流感病毒的疫情是在1994年報(bào)道的,隨后在我國(guó)各地均有H9N2禽流感疫情報(bào)道。H9N2毒株并不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,但在感染宿主后,能夠持續(xù)對(duì)外排毒,對(duì)禽流感的防控工作增加了難度。本試驗(yàn)為禽流感病毒的防控提供了一定的理論基礎(chǔ)。1.禽流感病毒的分離與鑒定本次試驗(yàn)從湖北省荊門、大冶兩個(gè)地區(qū)的大型養(yǎng)雞場(chǎng)采集病料,目前是采用雞胚注射的方法來(lái)增殖病毒。在接種9-10日齡的SPF雞胚尿囊腔后,收集含有病毒的尿囊液并進(jìn)行一系列的試驗(yàn),如血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等,篩選到了兩株禽流感病毒。并通過(guò)試驗(yàn)手段進(jìn)行亞型鑒定,確定兩株病毒均屬于H9N2亞型禽流感病毒。根據(jù)流感病毒命名的標(biāo)準(zhǔn)體系分別命名為A/chicken/Daye/DY0602/2017(簡(jiǎn)稱DY0602)和A/chicken/Jinmen/JM0305/2017(簡(jiǎn)稱JM0305)。對(duì)這兩株H9亞型禽流感病毒進(jìn)行血凝特性、EID_(50)(雞胚半數(shù)感染量)、MDT(雞胚最小致死量的平均致死時(shí)間)、ICPI(腦內(nèi)致病指數(shù))等相關(guān)性試驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)特性的研究。兩株H9亞型禽流感病毒DY0602、JM0305的生物學(xué)特性符合禽流感病的基本特征,其EID_(50)分別為10~(-8.42)EID_(50)/0.1ml、10~(-7.42)EID_(50)/0.1ml;MDT值分別為72h、91h;ICPI值均為0。2.禽流感病毒的全基因組測(cè)序及分析為了進(jìn)一步了解從養(yǎng)雞場(chǎng)的病雞體內(nèi)所分離到的兩株H9N2亞型禽流感病毒的分子流行特征,首先進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定,獲得序列后進(jìn)行對(duì)比分析,并上傳至NCBI,獲得登錄號(hào)。其次進(jìn)行比較和分析兩株H9N2亞型禽流感病毒與NCBI已上傳的各個(gè)分支的代表毒株兩者之間的序列同源性關(guān)系、HA和NA這兩種氨基酸蛋白的裂解位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析。這兩個(gè)毒株的PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS基因的開放閱讀框分別由2280,2274,2151,1683,1497,1401,759,366個(gè)堿基組成,分別編碼759,757,716,560,498,466,252/97,121氨基酸殘基。這兩株病毒HA的裂解位點(diǎn)具有低致病性禽流感病毒的典型特征,均為RSSR/GLF。這兩株H9亞型禽流感病毒均處在歐亞分支中的CK-BJ-like亞分支。3.禽流感病毒對(duì)鵪鶉的致病性研究為進(jìn)一步了解H9N2亞型的低致病性禽流感病毒的生物學(xué)特性,我們通過(guò)試驗(yàn)將分離到的兩株H9N2亞型禽流感病毒人工感染4周齡鵪鶉,并在感染的24h后放入同居鵪鶉,檢測(cè)其臨床癥狀、排毒情況、血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)、臟器組織學(xué)變化,進(jìn)而觀察H9N2亞型禽流感病毒對(duì)鵪鶉的致病性及其接觸傳播能力。結(jié)果顯示:兩株H9亞型禽流感病毒感染宿主后均能通過(guò)喉頭和泄殖腔排毒,雖然不會(huì)引起鵪鶉明顯的臨床癥狀及死亡,但在做病理切片分析發(fā)現(xiàn)在各個(gè)臟器中均有不同程度的病變。在感染的第7d、第14d均可以檢測(cè)血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)。表明兩株H9N2亞型禽流感病毒在鵪鶉群中具有良好的水平傳播能力。近些年來(lái),由于人類對(duì)生態(tài)環(huán)境的改變,也導(dǎo)致自然界中病毒通過(guò)自身的變異去適應(yīng)環(huán)境的改變。禽流感病毒不斷的變異也給我國(guó)在禽流感的防控方面帶來(lái)了極大的困難。本研究進(jìn)行禽流感病毒地方流行株的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究,旨在了解湖北及周邊省市AIV的流行情況及毒株特征。同時(shí),本研究完成雞源JM0305株、DY0602株的全基因組序列測(cè)定與分析,初步了解雞源AIV的致病特點(diǎn)和探索毒株對(duì)其他物種的影響。另外,兩株分離株對(duì)鵪鶉的致病性試驗(yàn)也為鵪鶉疫病防控提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

使病毒不具有血凝活性。根據(jù)流感病毒命名的標(biāo)準(zhǔn)體系分n/Jinmen/JM0305/2017（簡(jiǎn)稱 JM0305）和 A/chicken/Daye/DY0602/2）。表 2.6 HA 及 HI 試驗(yàn)結(jié)果Table2.6 The result of HA and HI tests HA 效價(jià)（log2）HI 效價(jià)（log2）H9 H7 H5 ND 7 8 0 0 08 8 2 0 002、JM0305 分離株 PCR 結(jié)果： 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)驗(yàn)證，得到片段的大小與預(yù)期相同，大.1。

圖 2.2 雞胚感染 H9N2 禽流感病毒的臨床癥狀ig.2.2 chicken embryos infected with the isolated H9N2 A1.JM0305; 2.DY0602; 3、4.陰性對(duì)照0305 對(duì) 1 日齡雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）的測(cè)定結(jié)果：染 1 日齡的 SPF 雞后，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)并沒有出現(xiàn)任何本試驗(yàn)結(jié)果也符合國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定低致病力毒株的方法有很多，一般常用的幾種技術(shù)手段為病毒分離、血等。目前禽流感病毒的培養(yǎng)宿主通常是使用 9-11 日齡過(guò)觀察 DY0602、JM0305 兩株分離株感染 SPF 雞、H驗(yàn)的兩株 H9 亞型禽流感病毒均屬于低致病性禽流感病

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000; A. JM0305; B. DY0602M. DNA Marker DL 2000; A.JM0305; B.DY0602圖 3.1 H9N2 禽流感病毒 8 個(gè)基因節(jié)段 PCR 擴(kuò)增圖Fig.3.1 The electrophoresis results of amplification of 8 Fragments of H9N2 subtype AIV3.3.2 全基因組的測(cè)序及序列分析3.3.2.1 全基因組的序列分析結(jié)果將擴(kuò)增并經(jīng)鑒定后的 PCR 產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序后，將公司反饋的結(jié)果通過(guò) DNAstar4.0 分析軟件處理，得到全基因組的完整 ORF 序列，并上傳至NCBI，獲得登陸號(hào)如表 3.7 所示。表 3.7 JM0305、DY0602 分離株全基因組 8 基因片段的核苷酸序列分析Table 3.7 The genome characteristics of the JM0305、DY0602 isolated virus strains
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2843762