版病毒病(Prion disease)又稱傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy),是一種漸進(jìn)性、致死性的神經(jīng)退行性人畜共患病,該疾病的主要病理學(xué)變化為腦組織空泡樣病變、神經(jīng)元大量的死亡以及膠質(zhì)細(xì)胞的增多。目前的研究表明該疾病的致病原為朊病毒(PrPsc),它是通過(guò)正常細(xì)胞膜蛋白朊蛋白(PrPc)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變所導(dǎo)致的。線粒體是一種高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器,它通過(guò)大量多種GTP酶的調(diào)節(jié)不斷完成自身的分裂及融合,為細(xì)胞行使正常生理功能提供相應(yīng)的能量。反之,線粒體分裂融合功能紊亂會(huì)引起大量神經(jīng)元的死亡,最終誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病,如帕金森綜合癥(PD),阿爾茨海默病(AD),亨廷頓病(HD)等。GTP酶家族中Dynamin-likeprotein 1(DLP1)是細(xì)胞內(nèi)起主要作用的線粒體分裂蛋白,在所有的真核生物中序列非常保守并且廣泛分布。本研究使用Prion動(dòng)物模型及細(xì)胞模型,探索DLP1調(diào)節(jié)的線粒體動(dòng)力學(xué)變化與Prion疾病中神經(jīng)元大量喪失及神經(jīng)退行之間的關(guān)系。并為探索一種新型治療Prion疾病的藥物尋找一個(gè)靶點(diǎn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn);1.Prion疾病中神經(jīng)元及N2a細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)失衡及線粒體DLP1含量升高:PrP106-126處理的N2a細(xì)胞及Prion倉(cāng)鼠動(dòng)物模型中,線粒體形態(tài)發(fā)生改變—碎裂,線粒體脊結(jié)構(gòu)不完整;并且線粒體在神經(jīng)元內(nèi)的分布發(fā)生了明顯的變化:從均勻的分布在細(xì)胞體及細(xì)胞突中轉(zhuǎn)變到集中于細(xì)胞體內(nèi)分布;Prion疾病中在線粒體DLP1蛋白含量升高:在PrP106-126處理的N2a細(xì)胞及Prion倉(cāng)鼠動(dòng)物模型中,DLP1的表達(dá)量略微降低,但線粒體上DLP1的量卻顯著升高。2.Prion疾病中線粒體形態(tài)及功能的變化是由DLP1調(diào)節(jié)的:通過(guò)對(duì)于DLP1量的調(diào)控(過(guò)表達(dá)及RNAi技術(shù))觀察線粒體形態(tài)的改變,研究發(fā)現(xiàn)在PrP106-126處理的N2a細(xì)胞中DLP1的過(guò)表達(dá)可以產(chǎn)生類似PrP106-126處理的N2a細(xì)胞中線粒體形態(tài)學(xué)的變化;DLP1 RNAi可有效的抑制PrP106-126處理后細(xì)胞線粒體碎裂的現(xiàn)象;DLP1調(diào)節(jié)的線粒體碎裂引起Prion疾病中線粒體功能紊亂:在PrP106-126處理的N2a細(xì)胞中,線粒體膜電位及ATP下降,活性氧和ADP/ATP上升,DLP1RNAi可有效的緩解PrP106-126處理的N2a細(xì)胞中線粒體功能紊亂。3.DLP1調(diào)節(jié)的線粒體碎裂導(dǎo)致了 Prion疾病中神經(jīng)元活性的降低、凋亡及突觸可塑性:進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在PrP106-126處理的N2a細(xì)胞活性活性明顯降低,體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明剪切后Caspase3的量明顯升高,細(xì)胞發(fā)生凋亡。DLP1RNAi可有效的抑制Prion疾病中細(xì)胞的活性及凋亡指數(shù);DLP1調(diào)節(jié)的線粒體碎裂與Prion疾病中神經(jīng)可塑性有關(guān)。通過(guò)對(duì)N2a細(xì)胞及Prion倉(cāng)鼠模型內(nèi)PSD95及樹(shù)突棘蛋白的檢測(cè),原代神經(jīng)元內(nèi)樹(shù)突棘及線粒體的共定位結(jié)果共同證明,DLP1調(diào)節(jié)的線粒體形態(tài)及分布是Prion疾病中突觸損傷及神經(jīng)退行的原因之一。綜上所述,本研究證明了 Prion疾病中,DLP1調(diào)控的線粒體動(dòng)力學(xué)失衡和線粒體功能障礙是導(dǎo)致Prion疾病中神經(jīng)元喪失及退行性病變的原因之一。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮略詞表
第一章 引言
    1.1 傳染性海綿狀腦病概述
    1.2 人克雅氏疾病
        1.2.1 克雅氏疾病的流行病學(xué)
        1.2.2 變異型克雅氏病的傳播方式
        1.2.3 Prion疾病跨種間傳播的研究
    1.3 病原學(xué)特點(diǎn)
        1.3.1 朊蛋白低聚物的研究進(jìn)展
        1.3.2 不同種屬來(lái)源的朊病毒易感性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性之間的差異
    1.4 PRPC的生物學(xué)功能
        1.4.1 朊蛋白低聚物的神經(jīng)毒性
        1.4.2 朊蛋白低聚物能夠引起神經(jīng)元的凋亡
    1.5 線粒體動(dòng)力學(xué)
        1.5.1 線粒體動(dòng)力學(xué)概念
        1.5.2 線粒體動(dòng)力學(xué)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
        1.5.3 神經(jīng)退行性疾病中線粒體動(dòng)力學(xué)的失衡
        1.5.4 線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)線粒體功能及凋亡
        1.5.5 線粒體動(dòng)力學(xué)與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育
        1.5.6 線粒體動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞凋亡
        1.5.7 線粒體動(dòng)力學(xué)與突觸可塑性
    1.6 本研究的目的和意義
第二章 PRION疾病中線粒體形態(tài)及分布發(fā)生改變
    引言
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制
        2.1.4 主要儀器及設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒Mito-GFP的大量提取
        2.2.2 Mito-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞
106-126處理神經(jīng)元'>        2.2.3 PrP^106-126處理神經(jīng)元
        2.2.4 免疫熒光檢測(cè)Mito-GFP的定位
        2.2.5 Prion倉(cāng)鼠腦組織樣本的制備
        2.2.6 透射電鏡觀察Prion金黃地鼠腦內(nèi)線粒體形態(tài)
        2.2.7 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)prion地鼠腦組織線粒體在神經(jīng)元中的分布情況
        2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體發(fā)生碎裂'>        2.3.1 PrP^106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體發(fā)生碎裂
        2.3.2 prion倉(cāng)鼠模型腦中線粒體發(fā)生碎裂
106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體分布發(fā)生改變'>        2.3.3 PrP^106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體分布發(fā)生改變
        2.3.4 prion倉(cāng)鼠模型腦中線粒體分布發(fā)生改變
    2.4 討論
第三章 PRION疾病中線粒體DLP1含量的升高導(dǎo)致了線粒體形態(tài)及功能的改變
    引言
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制
        3.1.4 主要儀器及設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
106-126處理N2a細(xì)胞'>        3.2.1 PrP^106-126處理N2a細(xì)胞
        3.2.2 Prion倉(cāng)鼠腦組織樣本的制備
        3.2.3 線粒體的分離
        3.2.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白
        3.2.5 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
        3.2.6 PCMV-HA-DLP1質(zhì)粒及DLP1RNAi轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞
        3.2.7 激光共聚焦檢測(cè)
        3.2.8 活性氧的測(cè)定
        3.2.9 ATP的檢測(cè)
        3.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 Prion疾病中DLP1表達(dá)量略有下降
        3.3.2 Prion疾病中線粒體DLP1的量顯著上升
106-126 N2a細(xì)胞中線粒體形態(tài)的改變'>        3.3.3 DLP1的量調(diào)控了PrP^106-126 N2a細(xì)胞中線粒體形態(tài)的改變
106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體功能紊亂'>        3.3.4 DLP1調(diào)節(jié)的線粒體形態(tài)的改變可抑制PrP^106-126處理的N2a細(xì)胞線粒體功能紊亂
    3.4 分析與討論
106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及突觸可塑性的改變'>第四章 DLP1調(diào)節(jié)PRP^106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及突觸可塑性的改變
    引言
    4.1 材料
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制
        4.1.3 主要儀器及設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)
        4.2.2 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
        4.2.3 PCMV-HA-DLP1質(zhì)粒及DLP1RNAi轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞
106-126刺激小鼠原代神經(jīng)元'>        4.2.4 PrP^106-126刺激小鼠原代神經(jīng)元
        4.2.5 Western blot檢測(cè)Caspase3、PSD95及Spinophilin蛋白
        4.2.6 慢病毒感染
        4.2.7 免疫熒光檢測(cè)樹(shù)突棘及線粒體共定位
        4.2.8 細(xì)胞活力的檢測(cè)
        4.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
106-126引起的細(xì)胞活性降低'>        4.3.1 抑制DLP1的表達(dá)可以減少由于PrP^106-126引起的細(xì)胞活性降低
106-126引起的細(xì)胞凋亡'>        4.3.2 Prion疾病中細(xì)胞凋亡上升,DLP1調(diào)節(jié)的線粒體動(dòng)力學(xué)變化可以調(diào)節(jié)PrP^106-126引起的細(xì)胞凋亡
        4.3.3 DLP1與突觸可塑性
        4.3.4 Prion疾病中原代神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)量的減少是DLP1調(diào)節(jié)的線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂導(dǎo)致的
    4.4 分析與討論
第五章 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Zhiqi Song;Deming Zhao;Lifeng Yang;;Metabolism of minor isoforms of prion proteins Cytosolic prion protein and transmembrane prion protein[J];Neural Regeneration Research;2013年30期

本文編號(hào)：2843605